小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导

分离树突状细胞（DC）的原理是依据DC的低密度和半黏附特性，DC缺乏Fc受体，可对获得的DC进一步纯化。这种方法获取的DC数量有限。细胞因子诱生法是目前体外扩增DC常用的方法。其中，扩增效果最好的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和白细胞介素4（IL-4）。     

人外周血及脐血树突状细胞的体外分离培养

取正常人外周血或脐血,经淋巴细胞分离液分离,取中间白膜层,培养板中进行粘附,粘附细胞加培养液和细胞因子（外周血加GM－CSF和IL－4,脐血加GM－CSF和TNF－α）培养,对其形态、表型和功能分别进行鉴定和测定。结果表明约经过1周左右培养,悬浮细胞表现为典型的DC形态,带有毛刺样凸起,经DC单克隆抗体染色后用流式细胞仪测定脐血72％为DC,外周血93％为DC,并且可以刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应。所以通过这样的不同细胞因子组合可以从人外周血和脐血中诱导培养出大量的DC细胞,为其进一步的研究奠定了基础。     

人树突状细胞体外直接抑瘤作用研究

目的：诱导获得人外周血树突状细胞(DCs)，研究其体外直接抑瘤作用及机制。方法：自正常人外周血分离获得单核细胞，体外rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导培养，观察细胞形态并检测其相关表型；利用MTT法检测所诱导DCs及其培养上清对不同肿瘤细胞系的体外直接抑瘤效应。结果：诱导5—7天后的悬浮细胞具有典型的DCs形态，流式分析显示HLA-DR表达率为64．02％，CD14表达率为2．34％；抑瘤实验显示：DCs对HT29、Hela及HepG2．2．15三种肿瘤细胞系的生长具有明显抑制，其抑制率分别为20．16％，25．44％，75．41％，而对Lovo和HepG2两种肿瘤细胞系，则无明显的抑制作用。DCs培养上清均未见明显的抑瘤效应。结论：人类DCs可对某些肿瘤细胞的生长产生直接抑制作用，但对不同的肿瘤细胞其作用不同。此作用可能由DCs与肿瘤细胞的直接接触而触发，而与DCs分泌的细胞因子关系不大。     

人脐血来源的树突状细胞的体外培养扩增

目的于体外从人脐血中培养扩增树突状细胞.方法从剖腹产胎盘中抽取脐血,分离单个核细胞,按程序加入细胞因子组合(SCF+GM-CSF+IL-4+TNF-α)进行培养及相应的鉴定.结果培养至6～7 d即出现较为典型的DC,15 d培养周期结束后,经流式细胞仪检测,所得的细胞中,CD1a的表达率为18.53%,并表达功能相关分子CD40、CD86、MHCⅡ-DR,能刺激同种T细增殖.结论利用细胞因子组合可以从脐血单个核细胞中诱导出DC,从而为下一步的临床应用研究奠定基础.     

GM-CSF对TNF-α诱导白血病细胞凋亡的抑制作用

通过TNFα以及TNFα+GM-CSF对18例白血病患者髓性白血病细胞凋亡的影响研究,发现加TNFα组凋亡细胞数明显高于TNFα+GM-CSF组,两者比较有显著性差异（P<0.01）。本结果提示TNFα有捉进肿瘤细胞凋亡作用,而 GM-CSF则可抑制这种作用。     

小鼠骨髓树突状细胞制备方法的比较研究

为了比较GM CSF与IL 4 (IL 4DC )以及GM CSF与IL 3(IL 3DC )共刺激培养制备的两种树突状细胞 (DC )的差异 ,采用GM CSF (10 0 0U/ml)和IL 4 (10～ 2 0ng/ml)或IL 3(10～ 2 0ng/ml)从小鼠骨髓培养制备DC ,流式细胞仪分析表型 ,体外饲以颗粒化抗原 (与Latexbead交联的Ovalbumin ,微粒 OVA )或抗原多肽 (Ovalbumin的SL8表位 ,即SIIFEKL )后 ,测定两种DC体外对颗粒化抗原的摄取能力和对抗原多肽的递呈能力 ,以及体内对特异性CTL的诱导能力。结果显示 ,IL 3DC较IL 4DC胞体略大 ,但树突状分支略少 ,表达更高的F4 / 80和更低的NLDC14 5、CD4 0 ,而两者的共刺激分子CD80、CD86和MHCI类分子的表达率无显著差异。体外IL 3DC对颗粒化抗原具有更高的摄取能力和对SIIFEKL多肽有更强的递呈能力 ,但体内对特异性CTL的诱导能力二者无显著差异。研究表明 ,两种方法制备的DC在形态、表型、体外抗原多肽递呈和抗原摄取能力方面存在一定差别 ,但具有相似的体内细胞免疫应答诱导能力     

IL-17A 协同GM-CSF 和LPS 促进骨髓细胞衍生树突状细胞的分化和成熟研究

目的:探讨IL鄄17A 对小鼠骨髓细胞衍生树突状细胞分化和成熟的影响。方法:分离小鼠骨髓细胞,加入含GM-CSF(20 ng/ ml)RPMI1640 完全培基培养8 d,诱导小鼠骨髓单个核细胞向DC 分化,加入LPS(1 滋g/ ml)继续培养36 h,进一步诱导DC 成熟,同时在骨髓细胞衍生诱导DC 分化及成熟的不同阶段加入不同浓度的rmIL-17A(10、100 ng/ ml),采用流式细胞术检测DC 表面共刺激分子的表达,ELISA 方法检测DC 培养上清中IL-12p40 和IL-10 水平。结果:rmIL-17A 可促进GM-CSF 诱导骨髓细胞衍生DC 表面共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHC域的表达,且具有剂量依赖性,其中以高浓度rmIL-17A刺激组的CD40 及MHC域表达增加最显著;在LPS 诱导DC 成熟阶段加入rmIL-17A,骨髓细胞衍生DC 共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHC域的表达均明显增加,并且随着rmIL-17A 浓度的增加,CD86 和MHC域的表达水平也随之增高;同时与未加rmIL鄄17A 的对照组相比,低浓度rmIL-17A 组LPS 刺激骨髓细胞衍生DC 分泌IL-12p40 和IL鄄10 水平均显著增加(P <0.001),高浓度rmIL-17A 组IL-12p40 水平显著增高(P<0.001),但IL-10 水平没有变化。结论:IL-17A 可促进GM-CSF 诱导的骨髓细胞衍生DC 前体细胞表型发展,并能协同LPS 诱导骨髓衍生DC 的分化和成熟。     

BA46基因转染树突状细胞治疗乳腺癌的研究

目的探讨以乳腺癌特异抗原删46基因转导树突状细胞（DC）治疗乳腺癌的可行性。方法取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DC前体细胞），以AIM-V培养基于6孔板培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞（T细胞，冻存备用），取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带翻46基因的重组腺相关病毒rAAV／BA46/Neo，对照组以293细胞冻融液刺激，两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）、白细胞介素4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导DC前体细胞成熟。第7天，收集悬浮细胞（DC），显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析DC的表面标志CD80、CD86、CD40的表达情况；另取该DC与T细胞按1：20比例混合，含5％人血清蛋白的AIM—V为培养基，同时加入IL-2与GM—CSF，共育7d，诱导获得细胞毒性T淋巴细胞（CTL），取删46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，采用^51Cr释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪检测CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值。结果酗46基因转导的DC表面标志CD80、CD86、CD40的表达均明显高于对照组DC，所激活的T细胞对鲋46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T有很好的杀伤效果，此杀伤具有抗原特异性和MHC限制性，且该T细胞中CD8／CIM和CD8／CD56的比值均明显高于对照组（细胞裂解物冲击DC所激活的T细胞）。结论删46基因转染成功制备DC，并诱导特异的CTL，为乳腺癌的DC基因转染疗法打下基础。     

GM-CSF重组腺病毒扩增的骨髓树突状细胞体外经肿瘤抗原刺激后诱导抗肿瘤免疫应答

用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒感染小鼠骨髓细胞，观察扩增到的骨髓树突状细胞的生物学功能。结果表明，ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒一次性感染骨髓细胞，１ｗ后能从一只小鼠股骨中扩增到２．４×１０６～３．３×１０６树突状细胞，扩增到的骨髓树突状细胞表达ＭＨＣ－Ⅱ、ＭＨＣ－Ⅰ、Ｂ７－１、Ｂ７－２和Ｉ－ＣＡＭ－１等免疫分子，分泌一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ，对同种异体Ｔ细胞具有很强的刺激活性，体外经Ｂ１６肿瘤瘤苗刺激后免疫同系小鼠，能诱导出抗原特异性的ＣＴＬ活性，使免疫动物产生更强的保护性免疫反应，抵抗Ｂ１６细胞的攻击。提示可用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒从骨髓中扩增足够数量的树突状细胞，用于肿瘤的免疫治疗和基因治疗。     

人树突状细胞体外提呈与EB病毒感染相关肿瘤抗原的研究

目的建立从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞的方法 ,制备 EBV感染介导的相关肿瘤 (如何杰金氏病、鼻咽癌和 Burkitt's淋巴瘤等 )的疫苗。方法采用 Mini- MACS分离技术从正常人骨髓分离 CD34+ 造血干 /祖细胞 ,体外以重组细胞因子组合诱导培养 2周 ,同种混合淋巴细胞反应检测扩增 DCs的 T淋巴细胞刺激活性。结果从正常人骨髓分离得到高纯度 (>90 % )的 CD34+造血干 /祖细胞 ,经重组 h GM- CSF、h TNF- α、h IL- 3、h IL- 4的共同诱导培养 ,扩增得到大量DCs。扩增的 DCs表面具有不规则突起 ,高表达共刺激分子 CD1α,对同种异体 T淋巴细胞具有很强的刺激活性 ,负载抗原后刺激活性进一步增强。结论人 CD34+ 造血干 /祖细胞体外经 h GM- CSF、h TNF-α、h IL - 4、h IL - 3共同诱导培养 ,可生成大量功能成熟的 DCs,并可有效提呈与 EBV感染相关肿瘤的抗原 ,可望用于 EBV感染介导相关肿瘤的疫苗治疗。     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞（DC）奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖（LPS,1μg/ml）刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的　探讨兔骨髓基质细胞在体外的培养条件 ,为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定实验基础。方法　取兔新生仔长骨骨髓进行培养 ,观察其传代细胞生长特性和生长曲线 ,测定培养细胞分裂指数和贴壁率。结果　兔骨髓基质细胞生长至第 5代 ,性状稳定 ,生长曲线相似 ;第 4天分裂指数最高 ,为 92‰ ;传代后 10h贴壁率最高。结论　兔骨髓基质细胞在体外培养条件下 ,早期生长性状稳定 ,增殖速度快 ,适应性强 ,可作为骨组织工程学的种子细胞。     

小鼠骨髓来源树突状细胞的分离与扩增培养

目的 :探讨树突状细胞 (DC)分离纯化及其体外扩增的方法。方法 :无菌制备C57BL/6小鼠骨髓 ;依次用红细胞裂解液去除红细胞 ,通过半粘附法去除T、B细胞 ,又在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)和白细胞介素 4 (IL 4 )协同诱导下培育 ,DC前体分化发育成DC并扩增。在第 7天用脂多糖 (LPS)和肿瘤坏死因子 a (TNF a)刺激 4 8h ,检测细胞因子白介素 12 (IL 12 )浓度及细胞表面标志CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ。结果 :DC细胞数增加 ,其形态在光镜下多为特征性星形 ,也有梭形和多角形 ;至培养第 9天DC细胞表面标志CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ阳性率分别为 86 .32± 12 .14 %、76 .4 2± 8.4 5%、77.12± 9.0 5%、6 8.4 5± 6 .84 % ,IL 12浓度较未用LPS和TNF a组明显增加 (P <0 .0 1)。结论 :①结果所得细胞的形态和功能符合DC ;②用LPS和TNF a刺激可以获得成熟DC。     

体外培养小鼠骨髓树突状细胞的扩增、鉴定及形态学观察

目的建立体外培养和扩增树突状细胞(dendritic cell-DC)的方法,并进行形态学观察。方法在无菌条件下提取BALB/c小鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,以小鼠重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培养,免疫组织化学染色、光镜和电镜下观察树突状细胞的形态。结果体外培养2周后小鼠树突状细胞可达70%~80%,光镜下可见典型的树突状细胞形态,S-100蛋白染色均呈阳性。电镜下,培养的细胞具有典型树突状细胞的形态特征,细胞功能活跃。结论体外大量培养和扩增小鼠骨髓树突状细胞,具有典型的树突状细胞的形态,为研究树突状细胞的功能和表型以及抗肿瘤作用提供体外实验材料。     

IL-3对小鼠骨髓来源树突状细胞分化发育的影响

比较 GM- CSF IL- 4与 IL- 3 IL- 4两种方法培养制备的树突状细胞 (Dendritic cell,DC)在形态、产量、免疫表型和抗原摄取能力方面的差异。用 GM- CSF IL- 4和 IL- 3 IL- 4分别诱导小鼠骨髓来源的前体细胞分化为成熟树突状细胞 ,通过相差显微镜、扫描电镜、激光共聚焦扫描显微镜进行形态观察 ,流式细胞术分析细胞免疫表型和摄取抗原能力。结果表明 ,IL- 3 IL- 4诱导的 DC产量高 ,细胞纯度好 ,形态上与 GM- CSF IL- 4诱导的DC类似 ;细胞免疫表型显示高表达 MHC 类分子 ,但低表达或不表达 CD80、CD86 ;IL- 3 IL- 4诱导的 DC具有强大的摄取抗原能力。 IL- 3替代 GM- CSF可诱导低表达共刺激分子的耐受型 DC     

用骨髓间充质干细胞建立抗砷细胞模型

目的用低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓间充质干细胞（BMSCs），获得抗砷细胞，探讨机体抗砷机制。方法选取胎儿BMSCs，采用细胞抑制率在5％-10％时的NaAs02浓度（1μmol／L）作为砷诱导浓度，同时设不加砷培养的胎儿BMSCs作为同步对照，用噻唑蓝法（MTT）监测细胞抗砷性是否产生；采用氢化物发生．原子荧光方法检测细胞砷含量，二硫代二硝基苯甲酸直接显色法，比较抗砷细胞与同步对照组胞内GSH，GST等砷代谢指标的变化，验证细胞是否获得抗砷性。结果胎儿BMSCs经过18周NaAsO2诱导后，细胞对急性砷中毒的耐受性明显提高，排砷能力增强，细胞内GSH和GST活性增高。结论胎儿BMSCs在低剂量NaAsO2长期诱导下，能分化为具有抗砷能力的细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。     

Characteristic Morphology and Distribution of Bone Marrow Derived Cells in the Cornea

Enhanced green fluorescence protein (eGFP)‐labeled bone marrow (BM) cells were transplanted into syngeneic C57BL/6 (wild‐type) mice to investigate the distribution pattern, immunohistochemical characteristics, three‐dimensional structure, and ultrastructure of the BM‐derived cells in the mouse cornea using a fluorescence microscope, a confocal laser scanning microscope, and a transmission electron microscope. This study provided direct evidence that two morphologically distinct types of BM‐derived cells were distributed in the mouse cornea. The majority of the GFP(+) cells showed a flattened polygonal form with obtuse angles and these cells were distributed in the corneal stroma. The other type was the GFP(+) cells demonstrating slim cell bodies with long and extremely thin dendrites and which were distributed in the corneal epithelium. The immunohistochemical characteristics and ultrastructure of BM‐derived cells suggest that most of these cells have a macrophage lineage, whereas some cells in the corneal stroma do not. Interestingly, the direct intimate contact between GFP‐labeled BM derived cells and non‐GFP‐labeled resident cells within the corneal stroma were also clearly visualized at the fine structural level. These data provide new and more detailed insight into the nature of BM‐derived cells in the cornea. Anat Rec, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

骨髓间充质干细胞在肝部分切除模型小鼠体内向肝细胞分化

以含20%胎牛血清的DM EM低糖培养基,原代细胞直接贴壁培养,48 h后换液继续培养,分离BALB/C小鼠的骨髓间充质干细胞,该细胞分为CD44 CD29 与CD44-CD29 两群。将第5代骨髓间充质干细胞注入部分肝切除小鼠肝右叶,术后5 d和14 d分别处死动物,测体重、肝重与肝功,制备肝组织芯片,原位杂交和免疫荧光同步检测Y染色体与肝细胞标记(白蛋白或CK 18),并作图像叠加。发现移植组小鼠在移植后5 d与14 d在注射肝叶与非注射肝叶内皆可检出大量同时表达Y染色体与白蛋白及Y染色体与CK 18的细胞。术后14 d,移植组肝重与肝脏器指数高于模型组。表明骨髓间充质干细胞能在有再生需求的小鼠体内向肝细胞分化并参与再生。