体内和体外条件下Nogo-A在大鼠小脑颗粒神经元上表达差异的研究

Nogo-A是网膜家族蛋白的成员之一,在抑制成年哺乳动物中枢神经系统损伤后轴突再生的过程中发挥着重要作用。Nogo-A表达于寡突胶质细胞和多种神经元,但在成年动物的小脑颗粒神经元中却未检测到。为探讨Nogo-A在小脑颗粒神经元上的表达情况及其影响因素,本实验应用免疫荧光组织化学染色法研究了Nogo-A蛋白在新生大鼠脑切片上和不同体外培养条件下小脑颗粒神经元中的表达。结果显示:在体条件下Nogo-A蛋白在新生大鼠的小脑颗粒神经元上的表达逐渐减少,至新生14d时检测不到;而在体外培养的来源于新生7d大鼠的小脑颗粒神经元中Nogo-A蛋白持续表达,可维持到14d;与胶质细胞共培养,或加入胶质细胞培养上清的小脑颗粒神经元仍然表达Nogo-A蛋白。本研究结果表明,体内和体外两种条件下Nogo-A蛋白在小脑颗粒神经元上的表达存在差异,新生期Nogo-A在小脑颗粒神经元上的表达下调可能与Purkinje细胞有关,提示Nogo-A在生后发育过程中可能与神经元的迁移或突触的形成密切相关。     

NOS在大鼠胃肠肌间神经丛的分布模式

ＮＯＳ在大鼠胃肠肌间神经丛的分布模式肖岚蔡文琴（第三军医大学组胚教研室）本研究应用ＮＡＤＰＨ－ｄ组化染色法和图像分析技术对成年大鼠胃肠肌间神经丛中ＮＯＳ的分布进行观察，以期得到大鼠胃肠肌间神经丛的构筑模式，结果如下：①胃：各部分神经丛网格形态、密度、...     

一氧化氮合酶阳性神经元在大鼠胃肌间神经丛中的分布

目的：了解一氧化氮合酶阳性神经元在大鼠胃肌间神经丛中的分布规律。方法：采用还原性辅酶Ⅱ黄递酶组化法和消化道铺片技术观察了胃各部肌间神经丛中神经元的形态和分布。结果：一氧化氮合酶阳性神经元广泛分布于大鼠胃肌间神经丛中,其形态基本类似,以圆形和卵圆形为主。在胃不同区域神经元的分布密度、胞体大小和染色强度存在较大差异。从胃底、胃体至胃窦神经元密度逐渐增加,各处相关显著（Ｐ〈０．０１）。胃底部的神经元胞体     

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

麝香多肽体外诱导成年大鼠和人骨髓间充质干细胞定向分化为神经元的研究

目的:观察麝香多肽体外定向诱导成年大鼠和人骨髓间质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)分化为神经元的能力。方法:采用含100-150mg/L麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导成年大鼠和人BMMSCs分化为神经元,免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经巢蛋白(nestin)的表达。结果:成年大鼠和人BMMSCs在加入含麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导后,BMMSC胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:麝香多肽可以在体外诱导成年大鼠和人BMMSCs定向分化为神经元。     

早期运动训练对脑梗死后缺血半暗带GAP-43、Nogo-A及GFAP表达的影响*

目的： 探讨早期运动训练对脑梗死缺血半暗带区轴突生长相关蛋白43 （ GAP-43）、神经突起生长抑制因 子A（ Nogo-A）和神经胶质纤维酸性蛋白（ GFAP）表达的调控作用,及其对大鼠神经功能恢复的影响。方法 ： 健康成年雄性Wistar 大鼠,按随机数字表法分为假手术组、模型组、训练组。采用线栓法建立大脑中动脉闭塞 （ MCAO）大鼠模型,术后24 h 进行强度渐增的跑台运动训练14 d 和28 d。采用改良神经功能缺损评分（ mNSS） 评估神经功能;平衡木行走试验评估大鼠神经行为学改变;H-E 染色观察各组缺血半暗带区神经元病理形态学变 化;免疫印迹检测大鼠脑缺血半暗带GAP-43、Nogo-A 和GFAP蛋白表达变化;结果： 与假手术组相比,模型组 大鼠mNSS评分和平衡木试验评分均显著升高,脑缺血半暗带区GAP-43 和GFAP蛋白表达上调,而Nogo-A 的表 达下调。与模型组比较,跑台训练组大鼠mNSS评分与平衡木试验评分均显著降低,脑缺血半暗带区GAP-43 表 达上调,而Nogo-A 和GFAP表达下调。结论： 早期跑台训练可以促进轴突再生,抑制胶质瘢痕形成,最终改善 脑梗死大鼠神经功能障碍。     

CaM和Actin在大鼠皮层神经干细胞定向分化的神经元的共存表达

目的研究大鼠皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中钙调蛋白(calmodulin,CaM)与肌动蛋白(actin)的时空表达与两者的共存表达。方法采用细胞培养、免疫组化,图像分析术,免疫荧光双标技术检测神经干细胞定向分化为神经元过程中第1、3、5、7天的钙调蛋白与肌动蛋白的时空表达,共焦激光扫描显微镜(CLSM)下观察二者表达共存变化及其相关性。结果在大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化的神经元,CaM与Actin的时空表达随着分化时间的增加,表达逐渐增强,随神经元发育逐渐成熟,CaM与Actin的阳性表达也逐渐延伸到突起,分化7天阳性表达最强。CaM的表达与Actin表达基本一致,共存表达胞体和突起。结论在大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化的神经元CaM和actin共存表达,随着神经元分化发育成熟表达增强。     

Nogo-A在大鼠脑组织中的亚细胞定位

目的Nogo-A在中枢神经系统的髓鞘和神经元中广泛表达,并且有多种亚分布形式。在以往研究的基础上,将通过检测Nogo-A/B(N-18)在大鼠脑组织中的亚细胞定位,进一步获得Nogo-A在细胞核中表达的有力证据。方法通过差速离心法和NP-40处理得到大鼠皮层和小脑样本的纯化细胞核亚组分,利用Westernblot来检测各亚细胞成分中Nogo-A的表达。通过免疫荧光双标染色,共聚焦显微镜观察Nogo-A在大鼠皮层和小脑组织中的亚细胞定位。结果WesternBlot在纯化细胞核中可检测到清晰的Nogo-A条带。免疫荧光染色显示胞核内有免疫阳性物质表达,并且和Hoechst复染的胞核着色有广泛重合。结论Nogo-A在大鼠皮层和小脑细胞核中有明确表达,并且很有可能以全长形式入核。     

不同张力扩张子宫颈诱导大鼠延髓内脏带c-Fos及神经型一氧化氮合酶的表达变化

目的观察不同张力扩张子宫颈(UCD)诱导大鼠延髓内脏带神经元c-Fos和神经型一氧化氮合酶(n NOS)的表达变化,探讨UCD疼痛在延髓水平的传导机制。方法成年雌性SD大鼠随机分为对照组(UCD 0g)、宫颈扩张50g张力组(UCD 50g)和宫颈扩张100g张力组(UCD 100g)。UCD组大鼠实施50g及100g张力扩张刺激,UCD刺激后2h,取延髓组织采用还原型辅酶Ⅱ(NADPH)组织化学和c-Fos免疫组织化学双重染色法观察c-Fos、n NOS和c-Fos/n NOS阳性神经元的分布,Western blotting和Real-time PCR法分别检测c-Fos及n NOS蛋白和mRNA水平。结果 c-Fos免疫阳性神经元的细胞核为棕黄色,呈圆形或卵圆形,胞质不着色。n NOS阳性神经元的胞体和突起呈蓝色,胞核不着色,呈空泡状。c-Fos/n NOS双标神经元的胞体和树突染成蓝色,细胞核呈棕黄色,这些神经元主要分布于延髓孤束核(NTS)和外侧网状核(LRN)内。与UCD 0g组相比,UCD 50g组和UCD 100g组大鼠NTS和LRN内c-Fos、n NOS以及c-Fos/n NOS阳性神经元数量明显增加,染色明显加深,c-Fos、n NOS蛋白及mRNA水平均明显升高(P0.01)。结论大鼠急性UCD可导致NTS和LRN神经元c-Fos及n NOS张力依赖性表达增加,NTS和LRN内的n NOS阳性神经元可能参与UCD疼痛在延髓水平的传导。     

肿瘤抑制因子PTEN蛋白在成年大鼠腰段脊髓和背根节中的表达与分布

目的　观察肿瘤抑制因子PTEN蛋白在成年大鼠腰段脊髓和背根节中的表达和分布。　方法　免疫组织化学ABC法显示大鼠脊髓和背根神经节中PTEN阳性免疫反应产物。　结果　背根节神经元及穿越背根节神经纤维轴突有阳性免疫反应产物存在 ;PTEN阳性免疫反应产物在脊髓主要位于灰质神经元。　结论　PTEN在成年大鼠腰段脊髓和背根节神经元及神经纤维轴突中表达。     

Nogo—A及NgR在墨西哥钝口螈脑组织中的表达及意义

目的探讨勿动蛋白A（Nogo．A）及勿动蛋白受体（NgR）在正常墨西哥钝VI螈及其中脑胆碱能神经元损伤后脑组织中的表达。方法以正常墨西哥钝口螈脑组织和中脑胆碱能神经元损伤后第3、7、14、21天脑组织作为研究对象,采用免疫荧光技术观察正常墨西哥钝口螈脑组织中Nogo—A及NgR的表达;分别用荧光定量PCR和蛋白质印迹法（WB法）检测正常墨西哥钝口螈和损伤组脑组织中Nogo—A及NgR的mRNA含量和蛋白含量的变化。结果正常墨西哥钝口螈脑组织中存在Nogo．A及NgR的表达,在墨西哥钝口螈中脑胆碱能神经元损伤后（注入AF64A）第3天,中脑乙酰胆碱转移酶（CHAT）阳性细胞数明显减少,与正常组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,损伤后第7、14、21天均有ChAT、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）双阳性细胞,且随时间的延长而增加。中脑胆碱能神经元损伤后第3、7、14、21天脑组织中,Nogo．A的mRNA和蛋白水平的表达量与正常组比较差异均无统计学意义;而NgR的mRNA和蛋白水平的表达量均下降,与正常组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论中枢神经系统损伤后的再生可能与NgR表达量的下降有关。     

Oxidation induces autonomous activation of protein kinase C Apl I,but not protein kinase C Apl II in homogenates of Aplysia neurons

The longest central nervous system (CNS) specific isoform of the major myelin-associated inhibitor of neurite growth, Nogo-A, has previously been shown to be expressed largely in oligodendrocytes. Using an antibody raised against a recombinant fusion protein comprising amino acids 223-399 of Nogo-A, we show in this report that Nogo-A is also expressed in the cell body of a distinct set of CNS neurons. The antibody detects a single protein band of 220 kDa in rat brain lysate and neuroblastoma cell lysates. Immunofluorescent analyses reveal that Nogo-A is found largely in the endoplasmic reticulum of neuroblastoma cell lines SH-SY5Y and NIE-115. In the mouse CNS, Nogo-A can be found in specific subsets of neuronal cell bodies in addition to oligodendrocytes, but not glial fibrillary associated protein positive astrocytes or MAC-1 positive microglia. Our results provide a conclusive demonstration of the expression of Nogo-A in CNS neurons, which suggests that Nogo-A may have distinct endogenous roles in neurons other than its known ability to inhibit neurite growth.     

体外培养海马神经元生长过程中Nogo-A分布的变化

目的 探讨Nogo-A在神经元中的表达与神经元发育分化的关系，以推测Nogo-A在中枢神经系统发育分化过程中的意义。方法 采用怀孕18d大鼠胚胎海马神经元体外高密度和低密度培养方法，应用免疫荧光细胞化学染色和Western blot，观察Nogo-A在体外培养的大鼠海马神经元的分布模式及其在不同生长阶段的变化。结果 Nogo-A在海马神经元生长过程中均表达，主要分布在胞浆、胞膜和突起上。神经元突起形成过程中，Nogo-A主要表达于突起的近端，在轴突上随着轴突的伸长逐渐表达于轴突远端和生长锥。Nogo-A在成熟神经元网状的突起上呈串珠样分布。结论 Nogo-A在中枢神经系统中具有不同于抑制作用的其他功能，可能参与神经元突起生长、轴突投射等过程。     

神经元Nogo-A的表达与其髓鞘化关系的研究

目的探讨神经元表达Nogo鄄A蛋白的情况,对Nogo鄄A的功能作初步了解。方法采用免疫组织化学方法,观察神经元表达Nogo鄄A的情况,并设置对照组。结果成年大鼠脊髓内神经元和背根神经节的大﹑中﹑小细胞中都出现Nogo鄄A阳性免疫反应,在胞浆和胞核中表达。结论大鼠神经组织中神经元都可能有Nogo鄄A的表达,表明神经元表达Nogo鄄A与该神经元轴突的髓鞘化没有联系,提示神经元中的Nogo鄄A的功能可能不参与髓鞘形成。     

血红素氧合酶系统对一氧化碳中毒后体外培养少突胶质细胞Nogo-A的影响

BACKGROUND: Cerebral white matter demyelination is outstanding in the images of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide (CO) poisoning. Since Nogo-A and Nogo-receptor are expressed in onoligodendrocytes and neurons respectively, we infer that Nogo-A system is involved in brain injury after acute CO poisoning and related to delayed encephalopathy after acute CO poisoning. Endogenous CO is a gaseous messenger, which is the metabolic product of hemeoxygenase. There is no report about the CO effect on Nogo-A system till now.OBIECTIVE:To in vitro culture oligodendrocytes using endogenous CO, inhibit the activity of hemeoxygenase system using zinc protoporphyrin-IX (ZnPPIX) and observe the variation of Nogo-A in oligodendrocytes at mRNA and protein levels.METHODS:Rat oligodendrocytes cultured in vitro were divided into control, CO, ZnPPIX groups. Cells in the CO and ZnPPIX groups were treated with 1% CO directly, In the ZnPPIX group, 10 μmol/L ZnPPIX was added into the culture medium before CO treatment. The expressions of Nogo-A mRNA and protein at 6, 24, 48 hours after culture were compared. Differences in the peak levels of Nogo-A mRNA and protein between CO and ZnPPIX groups were detected using RT-PCR and immunohistochemistry respectively.RESULTS:The expression levels of Nogo-A mRNA and protein were significantly higher in the CO group than the control group and reached the peak at 24 hours of culture. Compared with the CO group, oligodendrocytes cultured with ZnPPIX showed higher expressions of Nogo-A mRNA and protein at 24 hours of culture. These findings suggest that except the influence of hypoxia occurring in CO poisoning, exogenous CO increases the expression of Nogo-A in cultured oligodendrocytes in vitro, and the heme oxygenase system can inhibit the expression of Nogo-A mRNA and protein.     

Nogo-A在小鼠胚胎新生视网膜节细胞及其轴突的表达

目的 研究小鼠胚胎阶段Nogo-A在视网膜节细胞(RGCs)及其轴突上的表达及时程变化. 方法 取不同发育阶段的小鼠胚胎,采用免疫荧光染色,以激光扫描共焦显微镜观察Nogo-A在视觉传导通路中的表达.并采用免疫双标染色确定视网膜中表达Nogo-A蛋白的细胞类型. 结果 在视网膜发育的早期阶段(E12),Nogo-A密集表达于具有放射状形态的细胞上,Nogo-A免疫阳性产物出现在胞质、胞膜以及轴突上.Nogo-A与Tuj-1双标染色显示,此阶段的视网膜中几乎所有RGCs及其轴突都表达有Nogo-A;在稍晚的发育阶段(E13),视网膜中表达Nogo-A的RGCs数量明显减少,且仅出现在节细胞层以外的室周带和睫状体边缘区.在视网膜的神经纤维层,大部分RGCs轴突不再表达Nogo-A,仅有少量视觉纤维为Nogo-A免疫阳性;RGCs的神经发生基本完成后(E15), 视网膜中几乎检测不到Nogo-A免疫阳性的细胞,但视网膜纤维层仍有少量表达Nogo-A的节细胞轴突.与之类似,视神经盘、视茎、视交叉和视束都观察到少量Nogo-A免疫阳性的轴突.值得注意的是,视束中表达Nogo-A的纤维集中位于表浅部位,而此处恰为新近到达轴突的通过部位. 结论 Nogo-A在视网膜RGCs以及轴突上表达的时程变化和位置特点提示,新生RGCs及其轴突表达Nogo-A,成熟后RGCs内Nogo-A的表达则下调.推测新生RGCs及其轴突中表达的Nogo-A可能与减少轴突分叉等细胞的内在功能有关.