PBP2a的分子生物学特性及其与MRSA固有耐药的相关研究

<正>甲氧西林耐药金葡菌(Methicillin Resistant Staphyloloccus Aureus,MRSA)是院内感染的重要致病菌之一,其致病性与甲氧西林敏感金葡菌(MetLicillinSensitiveS taphylococcus Aureus,MSSA)相似。主要引起化脓性感染,但几乎对包括甲氧西林在内的所有抗生素耐药,目前只有万古霉素和利福平敏感。自60年代Jevons首次报道MRSA以来,至80年代MRSA感染遍及全球,最高占金葡菌感染的53％。国内开展的研究较晚,主要集中在MRSA的药敏试验、分型、分布方面的研究。因此进一步研究其耐药机制,为合理使用抗生素或开发新的抗生素提供理论依据。     

MRSA-PBP2a单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立

【目的】应用抗PBP2a单克隆抗体,以化学交联法致敏羧化聚苯乙烯乳胶,建立快速检测MRSA-PBP2a的乳胶凝集法。【方法】以辛酸-硫酸铵法纯化PBP2a单克隆抗体,将纯化后单克隆抗体和羧化乳胶经碳化二亚胺（EDC）共价偶联,并对偶联条件（偶联抗体浓度、乳胶浓度、偶联时间和偶联缓冲液）进行探索和优化,建立检测PBP2a的乳胶凝集法。【结果】140mg/L的抗体浓度与15g/L的羧化聚苯乙烯乳胶,在pH 5.8缓冲液中偶联8h后有较好的凝集效果和偶联效率,所建立的乳胶凝集法敏感性和特异性良好。【结论】初步建立了检测PBP2a的胶乳凝集法,为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。     

头孢西丁替代苯唑西林检测"耐甲氧西林"的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌

目的探讨头孢西丁纸片扩散法替代苯唑西林检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的准确率。方法临床标本培养鉴定出的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性的葡萄球菌同时用苯唑西林和头孢西丁筛选(K-B法)耐药菌株,再用PBP2a胶乳法进一步检测耐药菌株的mecA基因。结果121株的葡萄球菌,对苯唑西林的耐药率为97.5%,其中金黄色葡萄球菌31株,表皮葡萄球菌67株,腐生葡萄球菌18株,溶血葡萄球菌5株,用PBP2a胶乳试剂和头孢西丁纸片检测金葡菌中MRSA发生率均为77.4%(24/31),凝固酶阴性葡萄球菌中MRCNS发生率96.6%(87/90)和94.4%(85/90)。头孢西丁纸片扩散法的符合率为99%(109/111)。结论苯唑西林纸片扩散法检测MRSA假阳性率较高,而头孢西丁纸片法(K-B法)与PBP2a胶乳凝集法检测MRSA和MRCNS的结果相近,适合实验室推广使用。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10的体外表达和鉴定

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)真核表达载体,在NIH3T3细胞中表达重组载体pcDNA3.1(+)-IP-10,并对其表达产物进行鉴定.方法 通过PCR扩增IP-10基因片段,通过酶切和连接反应,构建IP-10的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-IP-10在NIH3T3细胞的表达情况.转染的Nm3T3细胞通过G418筛选出稳定表达的细胞克隆,Western Blotting鉴定IP-10蛋白在细胞培养上清的表达情况.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组载体可在NIH3T3细胞表达.Western Blotting结果显示细胞培养上清有IP-10蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,为进一步研究其对Th1型自身免疫性疾病的治疗效果奠定基础.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp,9个插入片段中含14个编码基因,...     

抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testis like 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布.方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体.亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究. 结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体.ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽.人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色. 结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础.     

结蛋白的纯化、抗体的制备及免疫组织化学鉴定

参考Small和Geisler两法加以改进。从鸡肫中提取纯化结蛋白,用淋巴结内微量注射法制备兔抗结蛋白抗体。用免疫组织化学染色法(PAP法)对抗结蛋白抗体作鉴定。结果:心肌、骨骼肌、平滑肌(除主动脉平滑肌)呈强阳性反应;胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞、远端肾小管上皮细胞、汗腺分泌部上皮细胞部分呈弱阳性反应。     

C-反应蛋白抑制缺氧状态下人脐静脉内皮细胞表达低氧诱导因子-1a

OBJECTIVE: To investigate the effect of C-reactive protein (CRP) on expression of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha). METHODS: Using CoCl(2) (100 micromol/L) to simulate hypoxic condition for culturing human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), we examined the effects of CRP on expression of HIF-1alpha. The proteins were extracted from the cells after a 24-hour exposure of the cells to CRP of varied concentrations in the presence of CoCl(2), and Western blotting was performed for quantification of HIF-1alpha expression, the results were analyzed statistically with SPSS software. RESULS: CRP at the concentration of 5 microg/ml decreased the expression of HIF-1alpha (P<0.001), producing the maximum inhibitory effect at the concentration of 100 microg/ml, an effect exhibiting dose-dependence. CONCLUSION: CRP inhibits the expression of HIF-1alpha in HUVECs subjected to hypoxic condition, which serves as an important evidence for the inhibitory effect of CRP on angiogenesis in hypoxic condition.     

HER-2蛋白疫苗的制备及在小鼠中诱导的抗体应答

目的：制备HER-2抗原疫苗．方法：采用RT—PCR方法从HER-2＋SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA,构建pQE-30-HER-2原核表达载体,在大肠杆菌中表达HER-2胞外区蛋白．Ni—NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,Western Blot鉴定．用获得的蛋白免疫小鼠,检测重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答．结果：构建的pQE-30-HER-2质粒经酶切和DNA测序分析,结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同．构建的质粒转化DI-IS（x后经IPTG诱导表达,SDS—PAGE分析,该重组蛋白以包涵体形式表达,且与mAbHerceptin有较好的结合活性．包涵体用Ni—NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,最大限度的获得了可溶性的HER-2胞外区蛋白．用重组蛋白免疫小鼠,得到了较高的抗体滴度．结论：成功制备了HER-2蛋白疫苗并诱导出较高抗体滴度,为下一步工作打下基础．     

重组 PBP2a 转肽酶区蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

目的：筛选和鉴定重组青霉素结合蛋白2a（PBP2a）转肽酶区蛋白的核酸适配体。方法利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,以重组 PBP2a 转肽酶区蛋白为靶标,从单链 DNA 文库中筛选能与之特异性结合的核酸适配体。筛选产物克隆测序后,对其进行结构分析和特性鉴定。结果经过11轮筛选,单链 DNA 文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第8、10轮筛选产物克隆测序,对获得的40个适配体进行分析,一级结构分析显示40个适配体并无共同的保守序列,二级结构预测分析表明,其可分为3个家族。其中13号适配体与重组 PBP2a 蛋白亲和力最高,并能与之特异性结合。结论利用 SELEX 技术成功筛选出特异性结合重组 PBP2a 转肽酶区蛋白的核酸适配体,为探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊疗新途径奠定基础。     

金黄色葡萄球菌蛋白A Z结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot法分析鉴定;纯化的Sp A-3Z重组蛋白免疫日本大耳白兔,并分别于免疫前和免疫后采集血清,用ELISA法检测其多克隆抗体的反应和效价,并用Western Blot法分析多克隆抗体结合天然Sp A的特异性。结果:成功构建了p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒;该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Sp A-3Z重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示该蛋白的分子质量约为21 k Da,与理论分子量大小相符;日本大耳白兔经该蛋白免疫后可产生特异性的多克隆血清Ig G抗体,效价可达1:40 000;Western Blot法检测结果显示,在分子质量约42 k Da(天然Sp A蛋白)处出现单一条带,提示兔多克隆血清抗体可识别天然Sp A。结论:Sp A-3Z原核蛋白有较好的免疫原性和抗原性,制备的Sp A-3Z兔多克隆血清抗体Ig G效价高、特异性好,可进一步用于Sp A-Z相关的生物学和免疫学等功能研究。     

MRSA-PBP2a单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立

 【目的】 应用抗PBP2a单克隆抗体,以化学交联法致敏羧化聚苯乙烯乳胶,建立快速检测MRSA-PBP2a的乳胶凝集法?【方法】 以辛酸-硫酸铵法纯化PBP2a单克隆抗体,将纯化后单克隆抗体和羧化乳胶经碳化二亚胺(EDC)共价偶联,并对偶联条件(偶联抗体浓度?乳胶浓度?偶联时间和偶联缓冲液)进行探索和优化,建立检测PBP2a的乳胶凝集法?【结果】 140 mg/L的抗体浓度与15 g/L的羧化聚苯乙烯乳胶,在pH 5.8缓冲液中偶联8 h后有较好的凝集效果和偶联效率,所建立的乳胶凝集法敏感性和特异性良好?【结论】 初步建立了检测PBP2a的胶乳凝集法,为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础?     

婴幼儿耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染状况和耐药基因的研究

目的了解感染婴幼儿的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药性和耐药基因,明确检测青霉素结合蛋白2a(PBP2a)和甲氧西林耐药基因(mecA)的临床价值。方法用金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验和梅里埃鉴定金黄色葡萄球菌,同时用纸片扩散法完成12种常用抗生素的药敏试验。对头孢西丁的结果,按当年CLSI标准执行,用于判断菌株甲氧西林的耐药性。采用PBP2检测试剂盒检测PBP2a蛋白,PCR检测mecA基因。结果 2007-2009年婴幼儿共检出245株金黄色葡萄球菌,其中MRSA检出率为17.6%(43/245)。MRSA对庆大霉素、复方新诺明、克林霉素、红霉素、氯霉素的耐药性均显著高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(P<0.05),其余抗生素的差异无统计学意义(P>0.05),43株MRSA的PBP2a蛋白和mecA基因的检测结果全为阳性,阳性率为100%。结论用头孢西丁(30μg)能有效地筛查MRSA,检测PBP2a蛋白和mecA基因均能正确地确认MRSA。且检测PBP2a蛋白方便快捷,特异性好,值得临床推广。     

诱导表皮角质形成细胞体外分层的途径及机制

目的探讨诱导表皮角质形成细胞体外分层途径及机制.方法在体外培养状态下,利用气液界面培养法及高浓度钙离子诱导胎鼠皮片、表皮角质形成细胞分层,借助冰冻切片、免疫荧光及激光共聚焦等技术检测其分层层数及分化程度.结果胚胎龄16 d的胎鼠皮片经气液界面培养3 d后,其表皮基底上角质形成细胞由2层增加为5层;经气液界面培养7 d后,胎鼠皮片表皮基底上角质形成细胞的局部区域分层已可达8层,细胞呈现更为分化的形态.在高浓度Ca2 (1.5 mmol/L)条件下培养7 d后,培养角质形成细胞发生了分层,分化标记物角蛋白K10在分层角质形成细胞中的表达明显增加.结论气液界面培养法及高浓度钙离子能诱导表皮角质形成细胞的体外分层,同时促进其分化.     

五环三萜类柴胡皂苷单体抗耐MRSA活性研究

目的对柴胡进行有效成分分离,并对其抗菌作用明确的成分进行结构测定,确定其分子结构,得到结构明确的五环三萜类活性单体Bp3(saikosaponines,Bp3)。进一步深入研究该单体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)作用及其与头孢唑林的协同作用。方法参照美国临床实验室标准化委员会(national committee for clinical laboratory standard,NCCLS)标准,测定Bp3对20株MRSA的MIC及其与头孢唑林的协同作用。结果Bp3对MRSA的抑菌作用优于头孢唑林且联合用药时显著减少了每一药物的最低抑菌浓度值(minimal inhibitory concentration,MIC),在20株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均表现为协同或相加作用方式。结论结构明确的五环三萜类单体Bp3对MRSA有一定的抑制作用,且与头孢唑林有协同或相加作用。     

介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP功能肽段在E．coli中的可溶性表达及功能

目的：将介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP的重要功能肽段与GST蛋白在大肠杆菌中融合表达．方法：利用合成的特异性引物钓取金黄色葡萄球菌基因组中的目的片段,将其克隆人pGEX—KG载体,在大肠杆菌中与GST蛋白进行融合表达．结果：成功地表达了目的肽,可溶性的表达产物占细菌可溶性蛋白的20％左右,且目的肽与配基纤连蛋白Fn具有结合的能力．结论：成功地表达了介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP中的重要功能肽段,为研究金葡菌侵袭细胞的机制奠定了基础．     

布氏杆菌PBP39蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的获得纯化的布氏杆菌PBP39重组蛋白抗原,观察PBP39重组蛋白的免疫原性.方法扩增不同种布氏杆菌PBP39基因,测序、连接表达载体PET32a,诱导表达,柱纯化PBP39重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型.结果我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39基因与国外已报道的PBP39编码基因不完全相同.在蛋白N端58位碱基后多一G,造成移码突变.故在85、86、87位编码终止子TCA.而在134、135、136位的ATG又编码了新的起始密码.布氏杆菌PBP39蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40%,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1.结论我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP39重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌IsdB表位蛋白与HBc蛋白融合表达

目的:采用大肠杆菌表达HBc-IsdB_50-285融合蛋白,探讨其在原核表达系统中的表达效果。方法:设计并克隆HBc-IsdB_50-285融合基因片段,构建表达质粒pET-28-HBc-IsdB_50-285,并转化入E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE分析蛋白可溶性及相对分子质量;BCA法测蛋白浓度;采用免疫接种法检测重组蛋白的免疫活性。40只小鼠随机分为rIsdB+adjuvant组、HBc-IsdB_50-285+adjuvant组、HBc-IsdB_50-285组和PBS组,每组10只,间接ELISA法检测小鼠特异性IgG效价值,采用金黄色葡萄球菌Newman株对免疫后小鼠攻毒,检测各组小鼠重组蛋白免疫保护效果。结果:表达质粒pET-28-HBc-IsdB_50-285经测序及酶切鉴定证明构建正确;SDS-PAGE分析,重组蛋白以部分可溶形式存在于培养上清中,相对分子质量约为44 000,亲和纯化后蛋白质水平为1.0 g·L^-1。ELISA检测,使用rIsdB蛋白包被酶标板,HBc-IsdB_50-285+adjuvan组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值低于rIsdB+adjuvant组(P<0.01);使用HBc-IsdB_50-285蛋白包被酶标板,HBc-IsdB_50-285+adjuvant组的小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于rIsdB+adjuvant和HBc-IsdB_50-285组。攻毒实验,HBc-IsdB_50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率低于rIsdB+adjuvant组,但差异无统计学意义(P>0.05);且其与HBc-IsdB_50-285未添加佐剂组比较差异也无统计学意义(P>0.05);与PBS组比较,HBc-IsdB_50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球免疫保护率升高(P<0.01),HBc-IsdB_50-285组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率亦升高(P<0.05)。结论:HBc-IsdB_50-285原核表达载体构建成功;在大肠杆菌中成功表达具有较好生物活性的HBc-IsdB_50-285融合蛋白。     

22种中草药提取物体外抗菌实验研究

目的:测定芸香草等22种中草药提取物体外抑菌活性。方法:乙醇冷浸制备22种植物药材的乙醇提取物,观察其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白念珠菌、铜绿假单胞菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用,用琼脂打孔法对其抗菌活性进行筛选,通过倍比稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果:22种乙醇提取物中有6种对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白念珠菌、铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用,有7种对MRSA有较强的抑制作用,抑菌圈直径为15~27 mm,MIC为31.25~500 mg/L,MBC为250~2 000 mg/L,对白念珠菌、大肠埃希菌活性较弱。结论:芸香草、肉豆蔻等7种对所测金黄色葡萄球菌及MRSA具有较好的抑菌效果。     

体外培育牛黄诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的研究体外培育牛黄诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用及机制。方法用单层培养法培养HepG2细胞，用不同剂量的体外培育牛黄作用于HepG2细胞不同时间，用荧光显微镜、透射电镜观察细胞形态的改变及细胞凋亡，用流式细胞仪检测HepG2细胞的亚G1峰细胞（凋亡）率的变化。结果体外培育牛黄100～800ug／ml作用于HepG2细胞48h后，HepG2细胞表现为细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征性形态学改变；流式细胞直方图上可见亚二倍体峰，不同浓度作用于HepG2细胞24、36、48、72h后的细胞凋亡率均显著高于空白对照组（P〈0．01），400ug／ml浓度组与阳性对照FT207（100ug／ml）组比较无明显差异。结论体外培育牛黄能诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡。