利用发光自显影技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的　利用发光自显影技术建立一种快速、简便的结核分支杆菌利福平耐药性筛选方法。方法 利用重组的分支杆菌噬菌体可在活菌内增殖的原理,来检测结核杆菌在含利福平液体培养基中的生长状况;采用发光自显影方法检测发光强度并确定活菌数,对43份结核杆菌样本进行快速检测,并与L-J培养基检测结果进行对比。结果 发光自显影方法与L-J培养法相比,阳性率和真阴性率分别为95.7%、90%,最佳检测的细菌浓度为10⁷～10⁸CFU/ml,最佳药敏试验的利福平浓度为1mg/ml,利福平与结核分支杆菌孵育48小时后即可进行发光自显影分析。结论 生物发光方法可用于快速筛选结核分支杆菌的利福平耐药性,是一种简单、快速、灵敏、实用的利福平药敏筛选方法。     

利用发光自显影技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的 利用发光自显影技术建立一种快速、简便的结核分支杆菌利福平耐药性筛选方法。方法 利用重组的分支杆菌噬菌体可在活菌内增殖的原理，来检测结核杆菌在含利福平液体培养基中的生长状况；采用发光自显影方法检测发光强度并确定活菌数，对43份结核杆菌样本进行快速检测，并与L－J培养基检测结果进行对比。结果 发光自显影方法与L－J培养法相比，阳性率和真阴性率分别为95．7％、90％，最佳检测的细菌浓度为10^7-10^8CFU/ml，最佳药敏试验的利福平浓度为1mg/ml，利福平与结核分支杆菌孵育48小时后即可进行发光自显影分析。结论 生物发光方法可用于快速筛选结核分支杆菌的利福平耐药性，是一种简单、快速、灵敏、实用的利福平药敏筛选方法。     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

分支杆菌药物敏感性测定的几个问题

非结核分支杆菌病的治疗和药物敏感性测定最初是模仿结核病的治疗和结核分支杆菌药敏试验。但是,非结核分支杆菌在药物敏感性方面存在一些自己的特征。因此,与结核分支杆菌药敏试验方法有所不同。目前对分支杆菌药物敏感性研究尚欠深入,对其规律性认识不清,结果不令人满意。一、分支杆菌药物敏感性特征就其对药物敏感性而言,非结核分支杆菌存在三个特点:(1)药物敏感度幅度大,分布散。结核分支杆菌野生株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星等的最低抑菌浓度(ＭＩＣ)范围相差仅2～4倍,而鸟分支杆菌野生株对上述药物的ＭＩＣ范围则…     

噬菌体生物扩增法快速测定结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性的研究

目的 建立快速测定结核分支杆菌(MTB)丁胺卡那霉素耐药性的噬菌体生物扩增法,并探讨其在结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性测定中的应用价值.方法 应用噬菌体生物扩增法测定112株结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性,并与绝对浓度法结果进行比较,对不符合的菌株采用Baetee MGIT960测定其最低抑菌浓度(MIG).结果 以细菌接种量为10-3mg/ml,药物浓度5μg/ml、37℃作用24 h为药敏试验条件.噬菌体法测定112株结核分支杆菌临床分离株丁胺卡那霉素敏感89株、耐药23株,绝对浓度法敏感91株、耐药21株;两法测定均为敏感87株、均为耐药19株.在6株噬菌体法与绝对浓度法测定结果 不符的菌株中,4株噬菌体法与MIC测定结果 相符合.如以绝对浓度法药敏结果 为判断标准,则噬菌体法测定丁胺卡那霉素耐药性的敏感性为90.48%(19/21),特异性为95.60%(87/91),阳性预测值为82.60%(19/23),阴性预测值为97.75%(87/89),准确性为94.64%(106/112).结论 噬菌体生物扩增法测定丁胺卡那霉素耐药性简便快速,只需2 d时间.操作不需特殊仪器设备,具有很高的敏感性和特异性,可作为MTB的丁胺卡那霉素耐药性快速筛选方法,建议临床推广应用.     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

噬菌体裂解法与BACTEC-460法在结核分支杆菌快速检测中的比较

目的：比较噬菌体裂解法与BACTEC－460法在结核分支杆菌快速检测及鉴定中的价值。方法：应用噬菌体裂解法和BACTEC－460法分别检测30株结构分支杆菌临床分离株、10株非结核分支杆菌和7株非分支杆菌，以及60份临床确诊的肺结核患者的痰标本，结果：所有结核分支杆菌临床分离株噬菌体裂解试验均为阳性，而非结核分支杆菌和非分支杆菌均为阴性。41份BACTEC－460培养阳性和19份BACTEC－460培养阴性的痰标本中，噬菌体裂试验分别有34份（82．9％）和5份（26．3％）阳性。结论：噬菌体裂解法可以简便，快速地检测结核分支杆菌，并且具有较高的敏感性的特异性。     

抗结核药物诱导结核分支杆菌形成L型及其特性的观察

目的 观察常用抗结核药物对结核分支杆菌L型的诱导作用以及结核分支菌L型在非高渗透压培养基内的某些特性及其抗菌药物敏感性,探讨结核分支菌L型形成的机制及其在结核病的发生、诊断及治疗上的意义。方法 将结核分支杆菌接种于含有利福平、异烟肼、乙胺丁醇的非高渗透压培养基内,逐日在显微镜下观察结构分支杆菌L型的形成情况。L型形成后将培养物过滤,获得结核分支杆菌L型纯培养物并对其形态、培养、抗菌药物敏感性、结核分支杆菌特异性基因等进行观察。结果 结核分支杆菌在常规药敏试验浓度的利福平、异烟肼、乙胺丁醇的作用下均可形成L型。结核分支杆菌L型对这些抗结核药物不再敏感,但对链霉素、红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星等抗菌药物均敏感。结核分支杆菌L型在非高渗透压培养基内呈圆球或不规则形态的细胞,单个、成双或链状排列,沉于培养基底部生长,不粘附瓶壁,不运动,抗酸染色阴性,革兰染色阴性或阳性,保留了结核分支杆菌特异性PCR引物基因序列。结论 利福平、异烟肼、乙胺丁醇虽然能够杀灭结核分支杆菌细菌型,但也能够诱导其形成L型而造成这些抗结核药物对结核治疗无效。非高渗培养基传代培养的结核分支杆菌L型保留了与其亲代细菌型一致的PCR引物基因序列,以致可用结核分支杆菌特异性PCR鉴定。根据结核分支杆菌L型的药物敏感性特点,建议在使用抗结核药物治疗中须注意其L型的形成和联合使用结核分支杆菌L型敏感的抗菌药物进行治疗。     

结核分支杆菌利用福平药物敏感性的直接快速检测

探讨利用分子生物 学方法直接快速检测临床标本结核分支杆菌利福平（ＲＦＰ）药物敏感性的可行性。方法自行设计针对ｒｐｏＢ基因特异扩增的引物（扩增产物为１８３ｂｐ片段）,运用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染色法,检测４５株结核分支杆菌临床分离株,对其中部分菌株进行ｒｐｏＢ基因ＤＮＡ序列分析,运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染色法对７０份结核病患痰标本进行直接快速检测,并与药敏试验结果做对照分     

显微镜观察药物敏感性技术检测结核分枝杆菌应用效果观察

目的 探讨显微镜观察药物敏感性检测（MODS）方法用于结核分枝杆菌（MTB）分离培养和耐药检测的应用效果.方法 收集276份肺结核临床疑似患者的痰标本,用MGIT 960 TB、罗氏法、MODS法检测MTB.用MODS法对80株MTB临床分离株进行药敏检测,并将结果与传统罗氏法进行比较.结果 MODS技术直接检测痰标本的阳性率为46％,阳性检出时间中位数为9 d（7～12 d）.MODS检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇药敏结果与传统罗氏法符合率分别为95.0％、96.25％、97.5％、85.0％,检测敏感度分别为83.3％、95.65％、96.15％、70.83％,特异度分别为98.3％、96.50％、98.15％、91.07％.结论 MODS方法是一种快速简便、费用低、准确的诊断和药敏检测方法,具有广泛的应用前景.     

四川省非结核分枝杆菌耐药分析

目的 探讨非结核分枝杆菌(non - tuberculosis mycobacterium,NTM)的流行病学特征和耐药现状,为NTM肺病的防治策略提供科学依据.方法 对2002 - 2011年四川省结核病参比实验室收集的分枝杆菌进行药物敏感性检测及菌种鉴定.对确诊为NTM病例进行流行病学分析.结果 2002 - 2011年四川省结核病参比实验室对2356个分枝杆菌菌株进行菌种鉴定,确诊为NTM的为251株,占10.65％,其中245株对异烟肼、对氨基水杨酸钠、乙胺丁醇、利福平、链霉素等常用抗结核药物存在不同程度的耐药,耐药率高达97.60％,且大多菌株同时对多种抗结核药物耐药.结论 四川省NTM对抗结核药物的耐药率高,研究、探索抗NTM的新药及更为有效的诊断方法是当务之急.     

Antimycobacterial susceptibility against nontuberculous mycobacteria using brothmic NTM

PURPOSE: Recently the incidence of pulmonary nontuberculous mycobacteria infection has increased among patients not only implicated with AIDS, but also without predisposing conditions. However, an effective antimicrobial therapy for the disease has not been established yet, because of the absence of highly active therapeutic drugs. We compared the in vitro antimicrobial activities of five antituberculous drugs, clarithromycin and fluoroquinolones against 92 clinical isolates belonging to three species of slowly growing nontuberculous mycobacteria. MATERIAL AND METHODS: M. avium (31 strains), M. intracellulare (44 strains), and M. kansasii (17 strains), all of which were isolated from sputum specimens of previously untreated patients with pulmonary nontuberculous mycobacteria infection, were used. The eight agents tested were streptomycin, ethambutol, kanamycin, isoniazid, rifampicin, clarithromycin, levofloxacin and gatifloxacin. The drug susceptibility of these strains in terms of MIC (minimum inhibitory concentration) was determined by BrothMIC NTM. RESULTS: The MICs of rifampicin, clarithromycin, levofloxacin and gatifloxacin for all three species were low and gatifloxacin was more active than levofloxacin between two fluoroquinolones. Regarding clarithromycin, 100% of the strains were susceptible to 2 micrograms/ml or less and none of the strains were resistant on this level. In contrast, the MICs of ethambutol and isoniazid for M. avium and M. intracellulare were high and less active in vitro than the other antimicrobial agents. CONCLUSION: These MIC studies suggest that rifampicin, clarithromycin, levofloxacin, and gatifloxacin have excellent in vitro antimicrobial activities against M. avium, M. intracellulare and M. kansasii and especially clarithromycin may be very useful as a drug therapy for previously untreated patients. In the treatment of pulmonary nontuberculous mycobacterium infection, further studies are needed to evaluate the clinical effects of these drugs and to observe the drug resistance, on the basis of the results of the drug susceptibility test by BrothMIC NTM.     

MGIT 960系统行二线抗结核药物敏感性试验的实用性评价

目的 评价全自动BACTEC MGIT 960系统在结核分枝杆菌二线抗结核药物（second-line anti-TB drugs,SLD）药敏试验中的实用性。 方法 本实验纳入患者435例。该纳入患者均通过痰涂片抗酸染色（萋-尼法）镜检,L-J固体和MGIT 960系统液体培养及鉴定,共筛查出阳性菌株212例。212例阳性菌株分别进行一线抗结核药物异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（S）和乙胺丁醇（EMB）的耐药性试验,其中耐药菌株（所有耐药株）118例。以118例耐药株作为SLD药敏试验实验株,应用L-J和MGIT 960两种方法分别进行卷曲霉素（Cm）、卡那霉素（Km）、氧氟沙星（Ofx）和乙硫异烟胺（Eto）的药物敏感性试验,并计算出两方法药敏试验所需的时间和符合率;L-J和MGIT960两种培养方法的比较采用配对设计的卡方检验;两种方法检测结果的一致性用Kappa值检验判别。 结果 MGIT 960系统药敏试验所需时间平均10.0 d（1183/118）,L-J固体培养法所需时间平均28.5 d（3360/118）,两者相差18.5 d。MGIT 960与L-J培养法的SLD Cm、Km、Ofx和Eto敏感及耐药符合率和一致性检验Kappa值分别为88.1%（104/118）和0.520;95.8%（113/118）和0.815;91.5%（108/118）和0.824;71.2%（84/118）和0.375。 结论 MGIT 960系统液体培养法常用SLD药敏试验与金标准（L-J培养）比较除Eto外符合率高、一致性好;该方法检测快速、准确,具有很强的实用性,可作为结核分枝杆菌快速培养和药敏试验的新方法。     

手工MGIT法检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药的效果评价

目的 评价MGIT手工荧光判读法在检测结核分枝杆菌耐药的基层应用价值。方法 以常规L-J比例法为参照方法,比较分析手工荧光MGIT液体药敏法检测300株临床结核分离株异烟肼和利福平药敏效果。结果 手工MGIT液体药敏法检测异烟肼和利福平灵敏度和特异度分别为94.7%和92.6%、95.6%和98.8%。两种药敏方法的异烟肼符合率95.7%,利福平符合率97.7%,两种方法检测异烟肼和利福平敏感性的差异无统计学意义(P>0.05)。液体药敏阳性报告时间平均7.6 d,比传统比例法报告时间提前20.4 d。结论 手工MGIT液体药敏法与常规L-J比例法检测异烟肼和利福平敏感性结果一致性高,能快速、准确检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药,适合基层推广。     

广东省广州市2001-2004年分枝杆菌初步菌种鉴定与药物敏感性试验结果分析

目的了解广州市2001-2004年3年间分枝杆菌菌种的分布状态和抗结核药物的耐受性情况,为临床诊断和治疗结核病提供可靠的科学依据.方法对2001年9月-2004年3月从1 459例患者中共分离出的2 154株分枝杆菌进行菌种鉴定,并采用绝对浓度间接法对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌进行4种抗结核药物的敏感性试验.结果非结核分枝杆菌的分离率由1998年7月-2001年9月的16.5%上升至20.3%;对2 154株分枝杆菌中的1 703株结核分枝杆菌复合群菌株进行的药物敏感性试验结果显示：原始耐药率由1998年7月-2001年9月的14.4%上升至20.3%.继发耐药率则由原来的35.4%下降至32.3%;而非结核分枝杆菌对抗结核药物基本上呈现高度的原始耐受性.结论对临床分离出的阳性标本,有必要进行分枝杆菌的菌种鉴定和药物敏感性试验.     

广东省广州市2001—2004年分枝杆菌初步菌种鉴定与药物敏感性试验结果分析

目的了解广州市2001—2004年3年间分枝杆菌菌种的分布状态和抗结核药物的耐受性情况,为临床诊断和治疗结核病提供可靠的科学依据。方法对2001年9月—2004年3月从1 459例患者中共分离出的2 154株分枝杆菌进行菌种鉴定,并采用绝对浓度间接法对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌进行4种抗结核药物的敏感性试验。结果非结核分枝杆菌的分离率由1998年7月—2001年9月的16.5%上升至20.3%;对2 154株分枝杆菌中的1 703株结核分枝杆菌复合群菌株进行的药物敏感性试验结果显示:原始耐药率由1998年7月—2001年9月的14.4%上升至20.3%。继发耐药率则由原来的35.4%下降至32.3%;而非结核分枝杆菌对抗结核药物基本上呈现高度的原始耐受性。结论对临床分离出的阳性标本,有必要进行分枝杆菌的菌种鉴定和药物敏感性试验。     

MGIT960与罗氏培养法在结核分枝杆菌培养及药敏试验中的比对分析

目的 比对全自动Bactec MGIT960（MGIT960）系统与改良罗氏（L-J）培养方法 2者在结核分枝杆菌培养、鉴定及药敏试验中的优越性。 方法 按国家疾病预防控制中心（CDC）-碧迪项目辽宁工作方案要求和国际标准WS288-2009《肺结核诊断标准》纳入临床病例。本实验共纳入病例435例,其中男性319例,女性116例,平均年龄52.3岁（10～86岁）。上述每份病例标本均分别进行痰液涂片抗酸染色（萋-尼法）镜检,L-J固体培养和MGIT960系统液体培养。培养阳性者分别进行一线药物异烟肼（INH）、利福平（RIF）、链霉素（STR）和乙胺丁醇（EMB）的L-J法药敏试验（比例法）和MGIT960药敏试验;分别计算出抗酸染色镜检与MGIT960和L-J培养的符合率; L-J培养和MGIT960培养阳性检出率;L-J和MGIT960两种培养方法药敏试验所需的培养时间及符合率等。 结果MGIT960培养法和L-J培养法与痰涂片镜检的阳性符合率分别为90.8%（187/206）和89.3%（184/206）;MGIT960与L-J结果符合率92.8%（219/236）;MGIT960和L-J平均培养时间分别为9.5 d和31.5 d;MGIT960和L-J一线药物INH、RIF、STR和EMB敏感性试验的符合率分别为92.7%、95.9%、91.8%和97.3%。 结论 全自动MGIT960系统培养方法的敏感度和特异度高于L-J培养法,报告时间平均缩短至9.5-d,该系统是目前最为理想的快速结核分枝杆菌培养、鉴定和药敏试验检测系统。     

145株非结核分枝杆菌对10种药物的耐药性分析

目的了解我院非结核病患者分离的非结核分枝杆菌对10种药物的耐药状况。方法用MB/Bact 240分枝杆菌培养仪和改良罗氏管对患者的多种标本进行分枝杆菌分离培养鉴定,对分离到的分枝杆菌采用绝对浓度法对10种抗结核药物,利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素,利福喷丁、丙硫异烟肼、氧氟沙星、卷曲霉素、卡那霉素和对氨基水扬酸进行药物敏感性试验。结果 1722例患者的标本非结核分枝杆菌培养阳性145株,对10种药总耐药率97.2%（141/145）,单耐药率最高为异烟肼、链霉素和对氨基水扬酸,最低为氧氟沙星。结论非结核分枝杆菌耐药情况十分严重,应加强抗结核药物的耐药性监测;根据药敏试验选择科学有效的化疗方案。