实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

神经外科住院患者定植及感染产毒艰难梭菌的分子流行病学特征

目的 研究神经外科住院患者定植及感染产毒艰难梭菌的分子流行病学特征。方法 采用前瞻性研究方法,选取2018年11月-2019年4月所有徐州医科大学附属医院神经外科新入院的成年患者161例为研究对象。在入院后48 h内、入院后每周及发生腹泻时分别采集粪便标本,本研究的主要临床结局是发生艰难梭菌感染(CDI),未发生CDI的患者随访至出院或死亡。对采集的粪便标本进行艰难梭菌培养及毒素基因检测,对所有的产毒艰难梭菌进行多位点序列分型。结果 从41名患者的粪便中培养分离出产毒艰难梭菌共计50株,其中,30株菌株tcdA及tcdB阳性,占60.00%;17株菌株仅tcdB阳性,占34.00%;3株菌株tcdA、tcdB及cdtA-cdtB均阳性,占6.00%。7名患者发生CDI,CDI发病率为4.35%,其中6名患者在入院时定植产毒艰难梭菌。将分离的50株产毒艰难梭菌进行多位点序列分型,共分析出14个ST分型,其中3株二元毒素阳性菌株均为ST5型。研究期间,患者4与患者31、患者13与患者19检测到相同的ST型,且居住过同一病房或床位。结论 本研究未分离到高毒力菌株ST1/RT027型或ST11...     

不同产毒类型艰难梭菌耐药性特征分析

目的通过研究临床艰难梭菌菌株的临床特征和耐药性,为临床防治艰难梭菌提供理论依据。方法收集2015年全年分离自临床的艰难梭菌,采用PCR技术检测其毒素基因,采用琼脂稀释法检测其耐药性,对患者的临床资料进行分析。结果共收集临床送检粪便标本144份,分离培养出艰难梭菌33株,艰难梭菌阳性检出率为22.92%;科室分布以神经外科、神经内科和消化科为主;分离所得到的艰难梭菌体外实验均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感,对红霉素和亚胺培南耐药检出株数最多,其次为克林霉素;33株艰难梭菌毒素基因检测结果 A+B+菌株24株,A-B+菌株1株;未检测到二元毒素基因cdtA和cdtB;产毒菌(25株)和非产毒菌(8株),两组菌株均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感;非产毒艰难梭菌和产毒菌株对抗菌药物红霉素、亚胺培南、克林霉素、利福平和左氧氟沙星的耐药率比较,虽差异无统计学意义,但均高于产毒菌株;患者感染艰难梭菌后,均出现不同程度的腹泻,使患者病情加重,住院时间延长,并出现2例死亡病例。结论非产毒菌株对多种抗菌药物耐药率均高于产毒菌株,并出现对万古霉素敏感性降低的菌株,提示本地区艰难梭菌耐药性可能增加,甚至可能出现耐万古霉素的艰难梭菌。     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在10³～10³拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

艰难梭菌感染实验室检测方法进展

<正>艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是一种专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌,1935年首次在新生儿肠道正常菌群中被分离出来。1978年起人们发现该细菌是引起抗生素相关性腹泻、医院性腹泻及假膜性肠炎的主要病原体。有资料显示,25%~30%的抗生素相关性腹泻以及90%以上的假膜性肠炎均是由CD引起的,美国由艰难梭菌感染(Clostridium-difficile infection,CDI)所致的病死     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

神经外科患者入院时产毒性艰难梭菌定植率及其危险因素研究

目的研究神经外科患者入院时艰难梭菌携带情况与艰难梭菌定植的危险因素。方法采集2018年11月-2019年4月徐州医科大学附属医院神经外科病房新入院患者的粪便标本进行产毒艰难梭菌培养与A/B毒素检测,结合患者一般资料及病历资料等信息,分析产毒艰难梭菌定植的危险因素。结果 161例粪便标本共培养分离出艰难梭菌菌株26(16.15%)株,其中非产毒艰难梭菌菌株4株,产毒性艰难梭菌22株,产毒性艰难梭菌定植率13.66%。Logistic回归分析显示,3个月内抗菌药物使用史、3个月内住院史和糖尿病史为患者艰难梭菌定植的独立危险因素,OR值分别为3.55(95%CI:1.1～11.47)、3.80(95%CI:1.13～12.76)和4.60(95%CI:1.06～19.95)。结论神经外科患者入院时产毒艰难梭菌定植率介于其他医院的比例之间。既往抗菌药物使用、住院史及糖尿病史可以增加艰难梭菌定植风险,应加强对相关患者的监测和筛查,是否需要制定相应措施进行防控,仍需进一步的研究证实。     

Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测布鲁菌病的研究

目的 建立血液标本布鲁菌DNA荧光定量检测方法,探讨其临床应用价值.方法 用PUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染DH5a菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品;在布鲁菌基因组IS711序列设计一对引物和TaqMan MGB探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,并对该方法进行评价.结果 建立的布鲁菌DNA荧光定量PCR方法最低检出率为400拷贝/ml;批内误差为1.8％～6.5％,批间误差为2.6％～9.1％;在4.0×102～4.0×108拷贝/ml之间与Ct值具有很好的线性(Ct =-1.391 1 Ln (x) +41.65,r=-0.995 8);具有较好的稳定性.在布鲁菌临床监测中发现,157份血液标本,用荧光定量PCR检测与临床检查结果(临床阳性、慢性期患者、症状可疑、阳性畜周围人群与重点职业人群(重点人群)的阳性率和阴性对照的符合率分别为90.3％、40％、6.7％、12.2％和100％.结论 建立的荧光定量PCR检测方法能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.在临床布鲁菌基因诊断方面具有重要意义.     

产毒真菌多重实时荧光PCR快速检测方法建立

目的建立一种能够在单体系中同时检测产黄曲霉毒素真菌及3种潜藏性产毒真菌的多重实时荧光PCR快速检测方法。方法分别根据产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的蛋白活化基因aflR、ITS序列、β-微管蛋白编码区、LS rRNA,设计引物和探针,通过优化反应组分和反应条件,建立了可同时检测常见产毒真菌的实时荧光PCR方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行了分析。结果优化建立的反应体系对产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的检测限分别可达到3.37×10⁴、1.91×10⁴、1.53×10⁴和3.95×10⁴拷贝/反应。结论本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可在2 h内完成对产毒真菌的检测。     

Taqman MGB探针实时PCR快速检测副溶血性弧菌

[目的]建立一种对食品中副溶血性弧菌的快速检测方法。[方法]根据GenBank公布的副溶血性弧菌的toxR基因的保守序列,设计1对引物和Taqman MGB探针,建立基于Taqman MGB探针的实时PCR快速检测副溶血性弧菌方法。[结果]通过对20种细菌的DNA进行扩增,结果6株副溶血性弧菌均可产生特异性扩增,与其他细菌无交叉反应;对纯菌而言,菌液灵敏度为23／ml,DNA浓度为130Pg。定量关系式为：y=3．353151Ln（x）＋43．797989,R^2=0．947952。67份冷冻海产品中2份副溶血性弧菌实时PCR检测结果阳性,相对应的有1份样品副溶血性弧菌培养阳性,检测时间仅需2h。[结论]该反应体系具有高度的灵敏度和极高的特异性,可用于食品和食物中毒样品中副溶血性弧菌的快速检测。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR联合检测难辨梭菌菌属基因及毒素基因方法学的建立

目的 建立一种简便、快速难辨梭菌菌属鉴定及其毒素基因筛查的荧光定量PCR检测方法。方法 采用TaqMan-MGB探针,通过real-time PCR分析系统,同时检测难辨梭菌菌属基因磷酸丙糖异构酶（Tpi）、A毒素（TcdA）、B毒素（TcdB）及缺失部分基因的A毒素（TcdAT）,从特异度、灵敏度及其抗干扰性等方面评价该方法,并联合全自动酶联荧光免疫系统（VIDAS）检测50 例临床不明原因腹泻病例粪便标本探讨其应用价值。结果 难辨梭菌非产毒株 Tpi 基因（tpi）的检测下限是6×10^-2 CFU/μl,产毒株 tpi、tcdA、tcdB、tcdAT 的检测下限为 6×10^-1 CFU/μl;难辨梭菌非产毒株tpi检测下限批内、批间变异率分别为2.1%和2.3%;产毒株tpi、tcdA、tcdB、tcdAT的检测下限批内、批间变异率依次为3.0%和3.4%、2.9%和3.2%、5.3%和5.7%、2.7%和2.8%。临床常见分离菌株及梭菌属其他细菌对检测无干扰。50 例不明原因腹泻病例粪便标本中,采用TaqMan-MGB 探针实时荧光 PCR 与 VIDAS 酶标免疫检测 39 例阴性标本其符合率为 100%;6 例两方法检测均为阳性;3例VIDAS酶标免疫检测为可疑及2例为阴性,经TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测为A-/B＋菌株。结论 建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR具有高通量、高灵敏度和重复性好的特性,且可筛查携带缺失部分基因的TcdA难辨梭菌菌株。     

基于Taqman探针双重实时荧光PCR检测单增李斯特菌

目的:建立双重荧光PCR对单增李斯特菌(LMO)特异性检测同时检测其毒力基因的方法。方法:根据LMO溶血素基因hlyA和內华素基因InlA的保守序列分别设计特异性引物和Taqman探针,优化多重荧光PCR反应体系,进行特异性、敏感性试验。结果:用建立的方法检测LMO标准菌株和24株分离株均出现hlyA和InlA扩增曲线,而沙门菌等其他菌株未见扩增曲线;敏感性试验结果方法的敏感性达到2.5×102 cfu/ml。结论:本研究建立的LMO实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高,是快速检测LMO及其毒力基因的有效手段,可用于食品中LMO检测。     

使用Real-Time PCR粪便中检测艰难梭状芽孢杆菌

目的：探讨Real-TimePCR对粪便检测艰难梭菌的可行性。方法：以组织培养细胞毒素试验为标准，参考艰难梭菌的毒素A／B基因相应的引物和分子信标探针，对标准菌株和粪便提取的DNA实行Real-TimePCR扩增。结果：Real-TimePCR的敏感度为96．9％；特异性为100％；阳性预测值为100％；阴性预测值为98．3％。结论：Real—TimePCR与传统诊断方法相比具有快速、敏感、特异等优点，可以提高艰难梭菌的检测水平。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌

目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

Clostridium difficile PCR ribotypes in calves, Canada

We investigated Clostridium difficile in calves and the similarity between bovine and human C. difficile PCR ribotypes by conducting a case-control study of calves from 102 dairy farms in Canada. Fecal samples from 144 calves with diarrhea and 134 control calves were cultured for C. difficile and tested with an ELISA for C. difficile toxins A and B. C. difficile was isolated from 31 of 278 calves: 11 (7.6%) of 144 with diarrhea and 20 (14.9%) of 134 controls (p = 0.009). Toxins were detected in calf feces from 58 (56.8%) of 102 farms, 57 (39.6%) of 144 calves with diarrhea, and 28 (20.9%) of 134 controls (p = 0.0002). PCR ribotyping of 31 isolates showed 8 distinct patterns; 7 have been identified in humans, 2 of which have been associated with outbreaks of severe disease (PCR types 017 and 027). C. difficile may be associated with calf diarrhea, and cattle may be reservoirs of C. difficile for humans.