儿科铜绿假单胞菌的OprD基因突变及表达对碳青霉烯类抗生素耐药的作用

目的:探讨我院儿科病区分离的碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌(CRPA)流行情况及OprD基因突变及表达在碳青霉烯类耐药中的作用。方法:儿科分离的30株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌,随机扩增DNA多态性(RAPD)进行同源性分析;PCR法检测KPC、IMP、VIM、SPM等产酶基因和OprD基因并双向测序及比对;FQ-RT-PCR测定OprD基因的mRNA相对表达量;SDS-PAGE电泳分析OprD外膜蛋白缺失情况。结果:儿科病区30株CRPA中,检出IMP基因阳性菌株1株,接合试验阴性。oprD基因缺失4株(4/30),突变率100%(9/9),碱基突变主要集中在1010 bp~1136 bp和1212 bp~1355 bp区域。CRPA菌株的oprD基因相对表达量与非耐药组差异有显著性(t=6.145,P<0.05),oprD基因突变位点与其表达量之间无相关性。结论:oprD基因发生广泛突变及表达量降低或缺失是本院儿科CRPA菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因之一。     

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌及鲍氏不动杆菌的耐药性分析

目的探讨耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(PAE)及鲍氏不动杆菌(ABA)的临床分布与耐药特性,为临床抗感染治疗和合理使用抗菌药物提供依据。方法采用微量肉汤稀释法测定12种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果两年共分离耐碳青霉烯类PAE和ABA分别为261、117株,两者>80.0%来源于呼吸道标本,41.0%耐碳青霉烯类PAE和64.9%耐碳青霉烯类ABA来自于重症监护病房,耐碳霉烯类ABA的多药耐药性比PAE更为严重,该菌株除头孢哌酮/舒巴坦耐药率在23.1%外,其他均>70.0%,亚胺培南和美罗培南耐药率分别为93.1%和96.6%,而耐碳青霉烯类PAE对亚胺培南和美罗培南耐药性却差异较大,16.0%菌株对亚胺培南耐药,而对美罗培南敏感,其中可能存在不同的耐药机制。结论耐碳青霉烯类PAE和ABA的耐药率在不断上升,特别是多药耐药和泛耐药株的增多,因此应慎重、合理地使用碳青霉烯类抗菌药物,密切关注PAE和ABA耐药的发展,采取有效的感染控制措施。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的初步研究

目的分析临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药特征及对亚胺培南的耐药机制。方法采用BD Phoenix 100 全自动微生物分析仪进行细菌鉴定,纸片扩散法（K B法）进行药敏试验;聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶相关基因(IMP、VIM、OXA、GES)及外膜蛋白基因oprD2。结果耐亚胺培南铜绿假单胞菌对阿米卡星耐药率最低,为8.33%;对庆大霉素、妥布霉素的耐药率＜20%;第三四代头孢菌素、氨曲南、美罗培南、复方磺胺甲口恶唑、米诺环素等抗菌药物抗菌活性差, 耐药率＞60%,对氨苄西林/ 舒巴坦全部耐药。检测到1株OXA 17阳性菌,阳性率2.78%;oprD2缺失率为38.89%;未检测到其余耐药基因。结论耐亚胺培南铜绿假单胞菌除对氨基糖苷类抗生素耐药率较低外, 对其他常用抗菌药物耐药严重;膜蛋白OprD2缺失与碳青霉烯酶产生等机制导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药。     

临床分离多药耐药铜绿假单胞菌β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因研究

目的 了解安徽淮北地区临床分离多药耐药铜绿假单胞菌(PAE)中β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因存在情况.方法 对36株临床分离多药耐药PAE采用全自动微生物系统进行药物敏感性试验,用改良三维试验法检测各种β-内酰胺酶,用聚合酶链反应(PCR)检测14种β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因和外膜通道蛋白oprD2编码基因.结果 36株PAE中TEM、DHA、CTX-Ge和CARB的检出率分别为77.8%、69.2%、27.8%和25.0%,OXA-1、OXA-10的检出率均为16.7%,VIM-2的检出率为13.9%,IMP-1的检出率为2.8%,未检出VEB、SHV、GES、PER、GIM和SPM-2基因,有58.3%的菌株存在外膜通道蛋白oprD2基因缺失.结论 淮北地区临床分离的多药耐药PAE携带多种β-内酰胺酶基因,oprD2基因缺失率较高.     

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌相关耐药基因及Ⅰ类整合子的研究

目的了解我院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药相关基因及Ⅰ类整合子存在情况。方法29株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌,采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验,聚合酶链反应(PCR)方法检测Ⅰ类整合子、外膜孔蛋白OprD2基因、金属酶(MBL)IMP、VIM、GIM、SPM和IMI耐药基因。结果未发现对多粘菌素耐药,哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和替卡西林/克拉维酸耐药率分别为75.9%、86.2%和93.1%,阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、美洛培南、厄他培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南和哌拉西林的耐药率均为100%。检出OprD2基因缺失22株(75.8%),IMP-9阳性1株(3.4%),Ⅰ类整合酶IntlⅠ阳性26株(89.7%)。未检出VIM、GIM、SPM和IMI耐药基因。结论耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌多重耐药情况严重。外膜孔蛋白OprD2基因缺失是我院临床分离的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要机制,其次是产金属酶IMP-9耐药基因,Ⅰ类整合酶IntlⅠ携带率高。     

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC-2与NDM-1基因的研究

目的检测耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌产酶情况以及KPC-2和NDM-1耐药基因的检出,分析耐碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制。方法采用改良Hodge试验、亚胺培南-EDTA纸片协同试验和AmpC酶三维试验检测29株耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌产酶情况;PCR法检测KPC-2及NDM-1两种碳青霉烯酶耐药基因。结果 29株分离菌中26株菌改良Hodge试验阳性,7株亚胺培南-EDTA纸片协同试验阳性,7株AmpC酶三维试验阳性,16株携带KPC-2型碳青霉烯酶耐药基因,占55.17%,未扩增出NDM-1碳青霉烯酶耐药基因。结论耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌的耐药机制主要是产碳青霉烯酶。     

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制研究

目的探讨新疆地区临床分离的铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶、外排泵Mex AB-oprM和外膜蛋白OprD2表达水平及其与碳青霉烯类抗菌药物耐药性之间的关系。方法聚合酶链反应(PCR)和测序法分别检测1~4组铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶;RT-PCR检测1、2、4组铜绿假单胞菌外排泵Mex AB-oprM和孔蛋白OprD2的表达水平。结果含亚胺培南耐药和美罗培南耐药组均有≥42.9%检出亚胺培南(IMP)、VIM金属酶基因型;OprD2显著低于表达在亚胺培南与美罗培南同时耐药组(87.5%),高于亚胺培南与美罗培南同时敏感组(20.0%),差异有统计学意义;Mex AB-oprM在各组中分别有60.0%、57.1%、37.5%的高表达,差异无统计学意义。结论外膜的低通透性、金属β-内酰胺酶的水解和主动外排泵过度表达,三者相互协同作用是该地区耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的主要机制。     

耐碳青霉烯类抗菌药物病原菌的表型检测分析

目的了解耐碳青霉烯类抗菌药物病原菌的耐药机制,更合理地指导临床应用碳青霉烯类抗菌药物,降低多药耐药率。方法采用改良Hodge试验方法,同时采用双纸片法进行ESBLs酶检测。结果 145株多药耐药菌中44株(不动杆菌属40株,克雷伯菌属4株)产KPC型碳青霉烯酶。结论产KPC型碳青霉烯酶克雷伯菌属同时产ESBLs酶,耐碳青霉烯类抗菌药物不动杆菌属产KPC型检出率较高。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌外膜孔蛋白与β-内酰胺酶研究

目的探讨铜绿假单胞菌外科监护室分离株对碳青酶烯类抗菌药物耐药机制。方法琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC);提取β-内酰胺酶进行三维水解试验及等电聚焦电泳;紫外分光光度计测定酶活性;用PCR扩增IMP、VIM金属酶基因;用Western印迹分析外膜孔蛋白OprD2表达水平。结果从外科监护室分离的49株铜绿假单胞菌,有41株对亚胺培南耐药;耐药组34株菌产AmpC酶,其中8株同时产ESBLs酶,2株仅产ESBLs,未筛选出产金属酶菌株;亚胺培南耐药组酶活性(74.32±53.42)μmmol/mg与亚胺培南敏感组酶活性(8.7±16.16)μmmol/mg比较差异有统计学意义(P<0.01);耐药组OprD2表达均有不同程度的降低或缺失,而敏感组均正常表达OprD2,耐药组OprD2相对表达量(0.20±0.27)与敏感组(3.10±2.20)比较差异有统计学意义(P<0.01);未扩增出IMP、VIM金属酶基因。结论外膜孔蛋白OprD2表达降低或缺失以及高活性AmpC酶,是外科监护室耐亚胺培南铜绿假单胞菌的主要原因,与IMP、VIM金属酶关系不大。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量方法检测铜绿假单胞菌MexAB-OprM mRNA水平

目的建立检测铜绿假单胞菌MexAB-OprM mRNA含量的实时荧光定量逆转录(RT-)PCR方法,并用其测定铜绿假单胞菌PAE 01株和MexAB-OprM过度表达株mexAB-oprM的基因表达水平。方法基于SYBRGreenⅠ荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-mexB和pMD18-T-rpsL作为标准品,建立实时荧光定量RT-PCR方法;在Rotor-gene 3000型检测仪上测定了PAE 01株和MexAB-OprM过度表达株的MexAB-OprMmRNA的表达量。结果所建立的实时RT-PCR方法的mexB、rpsL在(102~109)拷贝/ml(、104~109)拷贝/ml范围内,Ct值与起始模板浓度具有良好的线性关系,二者相关系数分别为0.99 977和0.99 999;MexAB-OprM过度表达株的mexB相对含量显著高于PAE 01株(P<0.01)。结论成功建立了检测铜绿假单胞菌mexAB-oprM基因表达含量的荧光定量方法,MexAB-OprM过度表达株的MexAB-OprM mRNA含量明显高于PAE 01株。     

水杨酸盐体外抑制铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2的表达

目的探讨水杨酸盐对铜绿假单胞菌碳青酶烯类抗生素耐药机制的影响. 方法以亚胺培南为代表,分析不同浓度的水杨酸盐,对10株临床分离的铜绿假单胞菌体外抗菌活性、OprD2相对含量的影响. 结果随着水杨酸盐浓度的增高,亚胺培南体外抗菌活性逐渐下降,OprD2的相对含量逐渐减少. 结论水杨酸盐能抑制铜绿假单胞菌OprD2的表达,诱导其对碳青酶烯类抗生素的耐药.     

Identification of patients with Pseudomonas aeruginosa respiratory tract infections at greatest risk of infection with carbapenem-resistant isolates.

OBJECTIVE: To create a clinical tool based on institution-specific risk factors to estimate the probability of carbapenem resistance among Pseudomonas aeruginosa isolates obtained from infected patients. By better estimating the probability of carbapenem resistance on the basis of patient-specific factors, clinicians can refine their empirical therapy for P. aeruginosa infections and potentially maximize clinical outcomes by increasing the likelihood of appropriate empirical antimicrobial therapy. DESIGN: A retrospective, cross-sectional study. SETTING: Tertiary care academic hospital. PATIENTS: All adult inpatients who had a respiratory tract infection due to P. aeruginosa between January 2001 and June 2005. INTERVENTION: Data on demographic characteristics, antibiotic history, and microbiology were collected. Log-binomial regression was employed to identify predictors of carbapenem resistance among P. aeruginosa isolates and to devise the clinical prediction tool. RESULTS: Among 351 patients with P. aeruginosa infection, 44% were infected with carbapenem-resistant P. aeruginosa strains. Independent predictors of carbapenem resistance were prior receipt of mechanical ventilation for 11 days or more, prior exposure to fluoroquinolones for 3 days or more, and prior exposure to carbapenems for 3 days or more. CONCLUSIONS: With carbapenem resistance rates among P. aeruginosa isolates on the rise at our institution, the challenge was to identify patients for whom carbapenems would remain an effective empirical agent, as well as the patients at greatest risk for infection with carbapenem-resistant strains. The clinical prediction tool accurately estimated carbapenem resistance among this risk-stratified cross-sectional study of patients with P. aeruginosa infection. This tool may be an effective way for clinicians to refine their selection of empirical antibiotic therapy and to maximize clinical outcomes by increasing the likelihood of appropriate antibiotic treatment.     

Endemic carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa with acquired metallo-beta-lactamase determinants in European hospital

Acquired metallo-beta-lactamases (MBLs) can confer broad-spectrum beta-lactam resistance (including carbapenems) not reversible by conventional beta-lactamase inhibitors and are emerging resistance determinants of remarkable clinical importance. In 2001, multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa carrying bla(VIM) MBL genes were found to be widespread (approximately 20% of all P. aeruginosa isolates and 70% of the carbapenem-resistant isolates) at Trieste University Hospital. Clonal diversity and heterogeneity of resistance determinants (either bla(VIM-1)-like or bla(VIM-2)-like) were detected among MBL producers. This evidence is the first that acquired MBLs can rapidly emerge and establish a condition of endemicity in certain epidemiologic settings.     

泛耐药铜绿假单胞菌体外耐药模型构建及耐药机制的研究

目的 通过多种抗菌药物体外诱导构建泛耐药铜绿假单胞菌(PDRPA)体外模型,检测其相关的耐药机制;探讨联合抗菌药物体外诱导对铜绿假单胞菌( PAE)耐药性的影响.方法 采用梯度浓度琼脂平皿传代诱导法,将4株细菌接种于梯度浓度的药物平皿,直至对该药产生耐药,诱导前后测定细菌的敏感性,采用E-test法对诱导前的敏感株、诱导的泛耐药株以及临床分离的泛耐药菌株进行MBL检测；采用Real-time PCR技术,对诱导前的4株敏感PAE和诱导后的4株PDRPA以及4株临床分离的PDRPA进行主动外排系统的检测,包括:MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM.结果 经诱导后4株敏感PAE对抗菌药物的敏感性下降,MIC明显升高,按照CLSI耐药折点4株菌株全部转变为泛耐药菌株,4株临床分离的敏感PAE株诱导前后MBL检测均为阴性;临床分离的4株PDRPA株MBL检测有2株为阳性,诱导前的4株敏感PAE,4个外排系统均无高表达；相对于诱导前,经过诱导成为泛耐药菌株之后,4株耐药诱导株均存在MexA-OprM外排系统高表达,有1株存在MexCD-OprJ和1株MexEF-OprN高表达,全部菌株均无MexXY-OprM高表达；在临床分离的PDRPA中,有1株所有4个主动外排系统均高表达,有1株只有MexAB-OprM高表达,另外3个外排系统无高表达,另外2株4个外排系统均无高表达.结论 在体外抗菌药物的压力下,敏感的PAE可以经诱导变为PDRPA,耐药性稳定；体外诱导的PDRPA非产金属β-内酰胺酶,其耐药性的产生可能与主动外排泵有关,尤其是mexAB-OprM.     

ICU与非ICU铜绿假单胞菌感染的耐药性对比研究

目的 对比重症监护病房（ICU）与非ICU铜绿假单胞菌的细菌耐药性,为临床合理用药提供依据。方法 采用ATB细菌鉴定仪,对铜绿假单胞菌进行检测,药敏试验用K-B纸片法,根据2005年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判断结果,应用WHONET5软件对临床分离细菌的药敏结果进行数据统计分析。结果 ICU分离菌对亚胺培南和美罗培南耐药率为41.4%和43.0%,分别高于非ICU 33.3%和33.6%（P〈0.05）,对左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、氨曲南、阿米卡星的耐药率高于非ICU 8.6%-32.2%（P〈0.05）,ICU与非ICU对抗菌药物耐药率差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 ICU铜绿假单胞菌耐药性显著高于非ICU,尤其是碳青酶烯类抗菌药物,应引起临床医师的高度重视。     

肺部感染铜绿假单胞菌耐药性与抗菌药物治疗效果研究

目的 分析广州地区肺部感染患者分离的铜绿假单胞菌（PA)耐药性及整合子携带情况，探讨其抗菌药物治疗效果及影响因素。方法 回顾性调查2008年9月-2010年12月广州市3所三级甲等医院呼吸内科确诊为PA肺部感染患者的病历资料。收集上述患者标本分离的PA菌株，检测其对常用抗菌药物的敏感性；采用聚合酶链反应（PCR）法扩增菌株整合子片段，分析整合子的类型；分析影响PA肺部感染患者预后的可能危险因素。结果共收集PA 114株,检出多重耐药菌47株（41.23%）；71株（62.28%）PA检出Ⅰ类整合子。患者预后：21例（18.42%）治愈，63例（55.26%）好转，30例（26.32%）死亡。除庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林及哌拉西林/他唑巴坦外，Ⅰ类整合子阳性菌株对常用抗菌药物的耐药率明显高于Ⅰ类整合子阴性菌株（均P＜0.05）。影响PA肺部感染患者预后的危险因素包括整合子阳性、多重耐药菌株、不适当的经验性治疗、联合使用3类或以上抗菌药物、混合感染、碳青霉烯类抗生素的使用，而联合使用2类抗菌药物是患者预后的保护因素。结论肺部感染患者分离的PA多重耐药率及Ⅰ类整合子携带率较高，整合子与耐药性关系密切，应加强监测。尽量避免使用碳青霉烯类抗生素进行经验性治疗；可联合使用2类抗菌药物进行抗感染治疗。     

2010年度卫生部全国细菌耐药监测报告:非ICU住院感染患者细菌耐药监测

目的 了解全国2010年非ICU住院患者临床分离细菌分布及耐药性.方法 收集2010年1月1日-12月31日全国129所医院非ICU住院患者临床分离细菌药物敏感性试验数据,根据2010年美国临床实验室标准化研究所标准,用WHONET 5.6软件进行数据分析.结果 共获得临床分离菌216 872株,其中革兰阴性菌152 351株,占70.2％;革兰阳性菌64 521株,占29.8％;最常见的细菌依次为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的检出率分别为52.1％、83.8％;未发现耐万古霉素葡萄球菌,粪肠球菌和屎肠球菌对万古霉素耐药率分别为0.6％和3.3％,未发现耐利奈唑胺肠球菌属;耐青霉素肺炎链球菌检出率为10.7％;有5.9％和1.8％大肠埃希菌及9.1％和3.5％肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南耐药;铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率约为20.0％,鲍氏不动杆菌耐药率超过铜绿假单胞菌.结论 我国非ICU住院患者感染致病细菌耐药现象仍较为普遍,但同上年度相比,多数细菌耐药率未呈上升趋势.     

铜绿假单胞菌的耐药性变化及其DNA多态性分析

目的了解2001-2006年间铜绿假单胞菌的耐药性变化趋势并且对其DNA多态性进行分析。方法使用VITEK全自动微生物鉴定仪对铜绿假单胞菌临床分离株进行鉴定,药敏试验采用Kirby-bauer(KB)法,对分离的10株敏感株和8株耐药株进行随机引物PCR扩增。结果亚胺培南和头孢他啶的敏感性最强,头孢哌酮、哌拉西林、阿米卡星和环丙沙星的敏感率均超过50%;10株敏感菌分为8种基因型,8株耐药菌分为5种基因型。结论铜绿假单胞菌对多种抗菌药物较敏感,其耐药表型与其基因型之间具有一定的相关性。     

老年患者革兰阴性杆菌性肺炎的菌群分布及耐药性

目的 调查老年患者革兰阴性杆菌性肺炎的菌群分布及耐药性,为临床医师合理用药提供科学依据.方法 细菌培养和鉴定严格按照《全国临床检验操作规程》进行;药敏试验采用K-B法.结果 211株革兰阴性杆菌构成比依次为肺炎克雷伯菌占28.0％、铜绿假单胞菌占20.9％、大肠埃希菌占15.6％、鲍氏不动杆菌占10.0％等;主要革兰阴性杆菌对常用抗菌药物均产生了耐药性,肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物100.0％敏感,而铜绿假单胞菌及鲍氏不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物已产生了11.4％～14.3％的耐药率.结论 老年患者革兰阴性杆菌性肺炎的病原菌耐药性不断增强,应加大监测与控制力度.     

2008-2009年医院感染铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的 对医院感染的重要病原菌及其耐药性做定期分析,为临床合理选用抗菌药物及控制医院感染提供依据.方法 对医院2008-2009年临床标本中分离出的202株铜绿假单胞菌的耐药性进行回顾性对比分析.结果 15种抗菌药物中,2009年有9种抗菌药物的耐药率比2008年均有不同程度提升,提升较为明显的有:环丙沙星由2008年的17.05％升至2009年的27.I9％,头孢曲松由68.18％升至95.61％,头孢他啶由19.32％升至30.70％,头孢吡肟由25.00％升至31.58％,氨曲南由34.09％升至41.23％,哌拉西林/他唑巴坦由20.45％升至25,44％;2009年ICU的耐药率明显高于非ICU:亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、氨曲南、头孢他啶、左氧氟沙星及头孢吡肟在两病区之间差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 铜绿假单胞菌的多药耐药株呈逐年增加趋势,尤其是对碳青霉烯类抗菌药物耐药率的提升,应引起临床高度重视.