实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

实时定量PCR检测骨髓间质干细胞及肿瘤细胞BMI-1基因

目的　建立BMI- 1基因(theBcell specificsmoloneymurineLeukemiaVirusintegrationsite 1)表达的实时荧光定量PCR,利用该方法在基因转录水平上研究BMI- 1在间质干细胞 (MSCs)及肿瘤细胞中的表达水平。方法　通过RT- PCR,T- A克隆,real timePCR等方法精确测定并比较BMI 1基因在胚胎MSCs、成人MSCs、A549(人肺腺癌细胞株)、SW 480(人结肠腺癌细胞株)、U937(人髓系白血病细胞株)、健康人外周血淋巴细胞以及白血病细胞中表达水平。结果　测定绘制BMI 1基因的标准曲线(相关系数r=0. 998),胚胎MSCs中BMI- 1的表达水平高于成人MSCs,慢性粒细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)中BMI- 1的表达量分别高于急性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病,U937和A549中的表达量高于SW 480,健康人外周血淋巴细胞中BMI 1的表达明显低于慢性髓系白血病(P<0. 01)。结论　定量测定BMI -1的real- timePCR方法较稳定、准确。BMI- 1基因可以作为某些肿瘤特别是白血病治疗的靶点,其表达水平可作为判断肿瘤恶性程度的参考指标。     

肿瘤相关基因chp2在白血病细胞中表达的研究

为了探讨人类肿瘤相关基因chp2在白血病原代细胞和白血病细胞系中表达的特点，选择24例白血病患者、4种白血病细胞系及10名正常人外周血单个核细胞（PBMNC），用实时定量PCR（RQ—PCR）方法检测chp2基因的表达水平。结果显示，10例正常对照细胞chp2mRNA的表达检出率为80％，阳性的表达量为（0．744±0．682）×10^5cps／μl。白血病原代细胞和白血病细胞系chp2mRNA的表达量较正常对照组明显增高（p〈0．05），原代细胞中的7例急性髓细胞白血病（AML）、6例慢性髓细胞白血病（CML）、7例急性淋巴细胞白血病（ALL）和4例慢性淋巴细胞白血病（CLL）的表达量分别是（11．637±5.588）、（6．122±3．785）、（4．262±2．561）和（3．434±1．974）×10^5cps／μl；白血病细胞系中K562细胞、Jurkat细胞、HL-60细胞和M07e细胞的表达量为（5．243±1.852）、（4．463±1．621）、（4．137±1．837）和（2．578±1．137）×10^6cps/μl，白血病细胞系的表达量高于原代细胞。结论：人类肿瘤相关基因chp2在白血病原代细胞和白血病细胞系中表达水平明显增高，提示其在白血病细胞生长过程中发挥着重要的作用。     

实时定量PCR检测白血病相关miRNA方法的建立

本研究建立实时定量PCR（RQ-PCR）技术检测白血病相关miRNA的方法,探讨此方法在定量检测miRNA中的应用价值。通过提取82例慢性淋巴细胞白血病（CLL）、70例急性白血病（AL）患者骨髓或外周血标本总RNA,以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释,分别作miRNA及内参U6RNA的标准曲线并计算扩增效率;运用ABF7300定量PCR仪进行定量检测;采用SYBRGreen荧光染料法、以U6RNA作为内参照、循环阈值（ct）比较法进行miRNA表达相对定量分析,以检测CLL患者miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181b及AL患者miR．128．1、miR-223、let-7b、miR-155、miR-181a的表达。方法学考核参数包括特异性、线性范围、精密度和重复性。结果表明：RQ—PCR检测miRNA仅需10—50ng总RNA样本,检测下限为0．05ng,miRNA及u6的Ct值均在15—30之间,10倍系列稀释法制作的标准曲线呈现良好的线性关系（R^2〉0．980）,扩增效率均在0．9以上,溶解曲线均为单峰,PCR产物经琼脂糖电泳均显示较亮的目的条带,批内差和批间差分别小于4．8％和6．3％。结论：RQ-PCR技术检测白血病相关miRNA敏感、快速,高通量,节约成本,定量范围宽,极大的方便了对miRNA的定量研究。     

慢性髓系白血病中prame基因转录本的定量研究

本研究旨在分析慢性髓系白血病(CML)患者中黑色素瘤优先表达抗原(prame)的基因转录本表达状况及其临床意义。用实时定量PCR(RQ-PCR)方法对30例CML患者和15例缺铁性贫血(IDA)患者骨髓单个核细胞中prame基因转录本水平进行检测。结果表明:15例缺铁性贫血患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中prame转录本水平为0%-1.46%(中位0.19%),30例CML患者中BMMNC中prame基因转录本水平为0%-772.25%(中位8.28%),二组之间具有显著性差异(p0.001)。CML患者中prame基因转录本含量与bcr-abl融合基因转录本水平显著相关(r=0.708,p0.001);6例CML加速期(AP)和急变期(BC)患者中prame基因转录本水平明显高于24例慢性期(CP)患者(p=0.007)。动态检测2例CML患者在不同病程中prame基因转录本水平变化显示,AP及BC时prame基因转录本水平增高,经治疗后恢复至CP时prame基因转录本水平降低,与bcr-abl转录本变化趋势一致。结论:CML患者中prame基因转录本表达水平增高,且与病情发展相关,可用于病情监测。     

荧光定量PCR法检测多种肿瘤组织和细胞株中nucleostemin基因的表达

目的 建立实时荧光定量PCR技术检测nucleostemin(NS)基因在多种肿瘤组织及细胞株中的表达。 方法 构建NS基因和内参基因β-actin标准品,用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测NS基因在胃癌、结肠癌和直肠癌组织以及胃癌细胞株（BGC-823）、肺腺癌细胞株（A549）、肺巨细胞癌细胞株（PLA801-D95）、结肠癌细胞株（SW620）、人白血病细胞株（K562）、前列腺癌细胞株（PC3）的表达。 结果 NS基因在胃癌、结肠癌以及直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）,且在BGC-823的表达显著高于其他细胞株（P<0.05）。 结论 NS基因过表达可能在多种肿瘤,尤其在胃肠道肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。     

人胃癌组织LIN28基因的定量检测及意义

目的检测LIN28基因在胃癌组织及对应癌旁组织中的表达差异,分析其与临床参数间的关系及在胃癌发生、发展中的作用。方法用Trizol提取总RNA,RT-PCR检测30例手术切除的胃癌组织及相应癌旁胃黏膜组织中LIN28 mRNA的表达,用SYBR实时荧光定量PCR进行比较。结果胃癌组织和癌旁组织中LIN28 mRNA均为阳性;胃癌组织LIN28 mRNA的平均表达强度为1.80×10-4,癌旁组织的平均表达强度为7.41×10-4,经配对t检验,P<0.01,有统计学差异。LIN28的表达与其他临床参数无明显相关性(P>0.05)。结论胃癌组织LIN28 mRNA的表达较癌旁组织明显下降;LIN28的表达与患者年龄、性别、肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移等无明显的相关性。     

应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病

本研究旨在应用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD),采用B系ALL18对引物、T系ALL8对引物进行PCR反应扩增Ig/TCR基因重排,以Ig/TCR基因重排作为追踪的分子标记,应用SYBR Green I染料法对儿童ALL-MRD水平进行定量。研究结果表明:9例B-ALL患儿中有8例重排,找到患儿重排标记(marker)的机率为88.8%;并对诱导化疗后(第33天)骨髓MRD检测发现,其MRD水平明显下降。结论:本研究证实Ig/TCR基因重排可作为检测儿童ALL MRD标记,SYBR green I实时荧光定量PCR是一种可靠的、相对敏感的、并且比较容易的作为常规检测。     

实时定量PCR检测胃癌组织miR-20a及初步应用

目的建立检测人胃癌组织中miR-20a的实时荧光定量PCR方法。方法建立miR-20a标准曲线,评价该法检测的线性范围及灵敏度;对标准质粒扩增产物进行熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳检测以分析该法的特异性。取高、中、低3份不同浓度的标准质粒进行批内和日间变异系数(CV)的检测,分析该法的重复性。收集70例胃癌患者手术切除的癌组织和对应的癌旁组织,定量检测组织中miR-20a的表达水平。结果构建的实时荧光定量PCR法的灵敏度为101copies/μL,扩增的线性范围为101～109copies/μL;扩增产物的熔解曲线峰和电泳片段特异;3份不同浓度标准质粒定量检测的批内CV分别为6.33%、4.74%、5.89%,日间CV分别为9.45%、6.29%、7.48%。定量结果显示75.7%(53/70)胃癌组织中miR-20a的表达高于癌旁组织,差异有显著性(Z=-4.427,P<0.01)。结论建立的实时荧光定量PCR检测miR-20a的方法准确、快速、灵敏、特异,可用于胃癌组织中miR-20a的检测。     

实时荧光定量RT-PCR检测SALL4基因的临床应用研究

本研究旨在建立实时荧光定量RT-PCR（FQ RT-PCR）检测婆罗双树样基因4（sal-like4,SALL4）mRNA的方法并研究该基因在各类型白血病中表达情况.应用实时荧光定量RT-PCR技术定量检测60例急、慢性白血病患者和10例志愿者的标本SALL4基因.结果表明,SALL4基因在完全缓解（CR）组各类型白血病中不表达或低表达,与对照组相比无显著差异（P＞0.05）,而在初诊和复发组中高表达,表达量显著高于CR组（P＜0.05）,但在初诊和复发两组间表达量无显著差异（P＞0.05）,其中SALL4基因在CLL、T-ALL、M3中不表达或低表达;相关BMI-1基因与其表达规律一致,两者显著相关（r=0.825,P＜0.01）.结论：实时荧光定量RT-PCR技术检测SALL4基因具有高敏感性和高特异性等优点,可作为进一步研究SALL4基因的方法;SALL4基因有可能成为部分白血病治疗转归及白血病微小残留病（MRD）监测指标之一.     

胃癌组织中MTLC基因表达研究

目的研究MTLC(c-myc target from laryngeal cancer cells)基因在胃癌组织中的表达规律，探讨其在胃癌发生与发展中的作用。方法用反转录-聚合酶链反应法和免疫组织化学法分别检测MTLC mRNA及蛋白在胃癌组织及配对对照组织中的表达情况；用cDNA阵列分析正常胃组织中MTLC基因的表达差异。结果25份胃癌组织中有19份(76％)MTLC mRNA表达下调；免疫组织化学检测结果表明，MTLC蛋白在胃癌细胞中表达阴性，但在正常细胞中表达阳性；cDNA阵列分析显示，癌旁／正常组织、癌／癌旁组织、转移淋巴结／癌组织比值分别为0．527、0．277和0．466，表明正常胃组织中与癌旁组织中无差异，但癌旁组织、胃癌组织、转移淋巴结组织中MTLC mRNA水平依次递减。结论MTLC基因在胃癌组织中表达下调，其表达水平与胃癌的发展进程相关，提示MTLC基因可能在胃癌发生、发展及转移过程中起重要作用。     

CD68在胃癌组织中表达的意义及对肿瘤复发的影响

目的探讨巨噬细胞在不同分期的胃癌组织中的浸润情况以及对胃癌术后复发率的影响。方法采用免疫组化染色法检测CD68在52例胃癌术后病人组织中的表达,比较不同分期的胃癌组织中CD68表达的差异,以及CD68对胃癌术后病人复发率的影响。结果 52例胃癌组织切片中均见CD68表达,巨噬细胞浸润的密度为23-154/HP;肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）在Ⅰ-Ⅱ期胃癌组织浸润的密度为41.02±8.47/HP,在Ⅲ期浸润的密度为74.10±13.49/HP,在Ⅳ期浸润的密度为126.10±13.35/HP,三者比较有明显差异（P〈0.05）。高密度TAM浸润病人术后1年、2年、3年的累计复发率明显高于低密度的病人（P〈0.05）。结论巨噬细胞在胃癌组织中的浸润随着胃癌分期增加而增加,高密度浸润的肿瘤相关巨噬细胞预后差且更容易出现术后的复发。     

骨髓间质干细胞与肿瘤细胞中FN1、NME2、TIMP3基因表达检测

目的探讨纤维连接蛋白1(FN1)、肿瘤转移抑制基因2(NME2)、组织金属蛋白酶抑制因子3(TIMP3)基因在胎儿骨髓间质干细胞(FMSCs)、成人骨髓间质干细胞(AMSCs)、F6、SGC及白血病细胞中的差异表达,寻找肿瘤和白血病的分子生物学特征。方法分别提取FMSCs、AMSCs、F6、SGC及白血病细胞的总RNA,逆转录cDNA,以cDNA为模板用PCR和实时PCR技术分别测定FN1、NME2、TIMP3基因表达水平。结果AMSCs组FN1、NME2、TIMP3基因表达水平均高于FMSCs、F6、SGC组(P<0.001);F6细胞以及白血病细胞中未能检出TIMP3基因的表达。结论FN1、NME2、TIMP3基因的下调以及TIMP3基因的缺如,可能是FMSCs突变为F6肿瘤细胞的分子特征之一;TIMP3基因的下调可能是肿瘤细胞的一种分子标志。     

Foxp3在胃癌细胞中的表达

目的:观察胃癌细胞株及人胃癌组织中Foxp3基因和蛋白的表达水平和分布特点,探讨胃癌细胞通过表达Foxp3直接参与免疫逃逸的机制。方法:应用实时荧光定量PCR技术,分别检测3株胃癌细胞株(MGC-803、BGC-823、SGC-7901)中的Foxp3mRNA表达水平,并采用流式细胞术破膜染色检测其Foxp3蛋白表达水平。对30例胃癌病理切片进行免疫组织化学染色,观察Foxp3在胃癌组织中的分布特点。结果:3株胃癌细胞株中均检测到有Foxp3基因表达,Foxp3的相对表达强度依次为BGC-823>SGC-7901>MGC-803,Foxp3蛋白表达水平与mRNA表达水平一致。30例胃癌病理切片中27例胃癌细胞表达Foxp3,且细胞质和细胞核都有表达。结论:Foxp3作为调节性T细胞发挥特异性免疫抑制功能的关键基因,在胃癌细胞中也有表达,这可能是其直接参与胃癌细胞免疫逃逸的重要机制之一。     

transgelin基因在幽门螺杆菌感染胃癌细胞及人胃癌组织中的表达

目的研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染胃癌细胞及人胃癌、淋巴结组织中转凝蛋白基因(transgelin)的表达水平,探讨HP感染、transgelin基因与胃癌发生、发展的相关机制。方法用HP感染胃癌细胞系AGS和SGC-7901,同时收集胃癌患者手术切除的胃癌组织、切缘组织和淋巴结组织,提取及纯化总RNA。实时荧光定量PCR检测transgelin mRNA的表达水平,分析其与临床病理参数的关系。结果 transgelin mRNA在HP感染的AGS、SGC-7901细胞中的表达量增加,分别为对照细胞的11.39倍(t=30.025,P=0.000)、3.41倍(t=5.677,P=0.005);transgelin mRNA在胃癌组织、淋巴结组织中的表达增加,分别是切缘组织的6.48倍(t=2.290,P=0.026)、2.64倍(t=2.043,P=0.046);Ⅳ期胃癌组织transgelin mRNA表达量增加,是Ⅰ~Ⅱ期的2.32倍(t=2.111,P=0.049);淋巴结转移组是无淋巴结转移组的2.93倍(t=2.123,P=0.043)。结论HP可上调transgelin基因的表达,transgelin基因可能参与胃癌的发生、发展,且与p TNM分期及淋巴结转移相关。     

Smac和Apollon基因在胃癌中的表达及与细胞凋亡的关系

目的研究Smae、Apollon基因在胃癌组织表达及两者在胃癌发生中的作用关系。方法逆转录．聚合酶链式反应（RT-PcR）检测Smac、Apollon的mRNA在38例胃癌组织，15例癌旁组织和10例正常组织的表达情况。结果38例胃癌标本中表达Smac有20例（52．6％），而除3例癌旁组织外，其他癌旁组织和正常胃组织中均见Smae表达，可见8m8c在胃癌组织中低表达和非胃癌组织中高表达，具有统计学意义（P〈0．05）。Apollon在癌组织、癌旁组织和正常胃组织中分别有29例（76．3％）、4例（26．7％）和0例（0％）表达，Apollon在胃癌组织、癌旁组织和正常组织中Apollon的表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论Apollon在胃癌组织中高表达，其表达和Smac呈明显的负相关，两者的互相作用可能是导致胃癌发生、发展的重要因素。     

核干细胞因子基因在急性白血病细胞表达的检测和意义

目的检测核干细胞因子(Nucleostemin,NS)基因在急性白血病细胞的表达情况,探讨NS基因与急性白血病发病机制之间的关系。方法从NS基因的3个变异体中筛选出共同序列设计特异性引物,应用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)对白血病细胞系K562、HL60和急性粒细胞白血病(M1、M2a和M3),急性单核细胞白血病(M5a和M5b),急性淋巴细胞白血病(ALL)进行NS基因表达水平的检测,以健康人和良性贫血患者骨髓单个核细胞作为对照。PCR产物片段为418bp。结果K562、HL60明显高表达NS基因,它与内参相比灰度值分别为0·735±0·260、0·449±0·190;急性白血病病例有相似的结果。M1+M2a、M3、M5a、M5b、ALL的灰度值分别为0·687±0·210、0·408±0·160、0·866±0·270、0·448±0·190、0·403±0·190;对照组健康人和良性贫血不表达或极微弱表达NS基因;同一细胞类型白血病,细胞分化停滞在早期阶段的表达NS基因的水平明显高于细胞分化停滞在后期的白血病,如K562高于HL60;M1、M2a高于M3;M5a高于M5b(P<0·01)。结论NS基因在急性白血病细胞中呈高表达状态,这与白血病的发生、发展有一定关联;不同分化阶段的白血病细胞表达NS基因水平存在着差异。NS基因在急性白血病细胞的表达情况也显示了癌细胞和干细胞在某些方面的相似性,可能是一个潜在的基因治疗靶位。     

胃癌组织中环氧酶-2和白细胞介素-17的表达及临床意义的研究

目的了解胃癌组织中环氧酶-2(COX-2)和白细胞介素-17(IL-17)的表达,COX-2的表达与胃癌临床病理特征间的关系及两者的相关性。方法收集60例胃癌患者和20例健康对照者的组织标本。胃癌患者包括男44例,女16例,平均年龄(61.8±10.9)岁。根据TNM分期将胃癌分为TNMⅠ期(7例)、Ⅱ期(8例)、Ⅲ期(32例)和Ⅳ期(13例);按组织分化程度分为低分化组(34例)和中-高分化组(26例);按发病部位分为贲门癌(7例)和非贲门癌(53例);按有无淋巴结转移分为有转移(43例)和无转移(17例)。采用免疫组织化学染色测定胃癌组织中COX-2和IL-17的表达。结果胃癌组织中COX-2和IL-17的表达明显高于对照组,胃癌组织中COX-2的表达水平与胃癌的临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤大小及分化程度有关(P<0.01),与患者的年龄、性别、肿瘤部位无关(P>0.05)。胃癌组织中COX-2的表达水平与IL-17的表达水平呈正相关(P<0.001)。结论 COX-2和IL-17在胃癌的发生和发展中起促进作用,COX-2和IL-17可能互为正向调节因素。     

CD68在胃癌组织中表达的意义

目的探讨肿瘤相关巨噬细胞标志物CD68在胃癌组织中表达的意义。方法采用免疫组化染色法检测CD68在56例术后胃癌患者组织中的表达,比较肿瘤相关巨噬细胞在不同病理分期、不同分化类型以及有无区域淋巴结转移的胃癌组织中浸润的差异。结果 56例胃癌组织切片中均见CD68表达,巨噬细胞浸润的范围为23～154/HP;CD68在Ⅰ期胃癌组织表达的密度为(31.53±3.26)/HP,在Ⅱ期的密度为(44.97±6.53)/HP,Ⅲ期的密度为(75.66±13.71)/HP,Ⅳ期的密度为(127.00±12.62)/HP,不同分期胃癌组织中CD68密度比较差异有统计学意义(P<0.05)。CD68在无淋巴结转移组中的密度为(38.36±7.87)/HP,有淋巴结转移组的密度为(82.79±25.99)/HP,二者比较差异有统计学意义(P<0.05),CD68在高分化腺癌的密度为(39.05±9.68)/HP,中分化腺癌的密度为(48.23±13.43)/HP,低分化腺癌的密度为(87.73±25.21)/HP;低分化癌的CD68密度与中分化及高分化癌的CD68密度差异有统计学意义(P<0.05),高分化癌与中分化癌比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论随着胃癌的进展,肿瘤相关巨噬细胞在胃癌组织中的浸润密度也随之增加,CD68在胃癌组织中阳性表达是胃癌预后不良的重要因素。     

胃癌组织中ZAC与生长抑素表达的相关性

目的 研究胃癌组织中ZAC和生长抑素表达的相关性,探讨胃癌组织中ZAC与生长抑素的表达与胃癌临床病理学特性的关系.方法 应用免疫组织化学技术检测30例胃癌患者手术切除标本及其相应癌旁组织和正常胃黏膜组织中ZAC和生长抑素的表达.结果 胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织中ZAC的阳性表达率分别为33.3%(10/30)、73.3%(22/30)和66.7%(20/30);生长抑素的阳性表达率分别为36.7%(11/30)、53.3%(16/30)和73.3%(22/30).胃癌组织中ZAC和生长抑素的表达阳性率均明显低于正常胃黏膜组织(均P<0.05).胃癌组织中ZAC与生长抑素的表达呈明显正相关(r=0.636,P<0.05).ZAC与生长抑素的共表达与胃癌的分化程度及浸润深度有明显关系(P<0.05),而与淋巴结转移无明显关系(P>0.05).结论 胃癌组织中ZAC与生长抑素的表达具有明显相关性,生长抑素可能与ZAC协同参与胃癌的发生和发展.