外周血干细胞冻存的探讨

目的　对冻存外周血干细胞所用的冻存液配方 ,冻存温度 ,存放时间等作一探讨。方法　用血细胞分离机采集经化疗药物及G CSF联合动员的肿瘤患者外周血干细胞 ,用 10 %DMSO 自体血浆或 5 %DMSO 6%HES 4%人血清白蛋白作冷冻保护剂 ,分别于液氮中和 -80℃低温冰箱中冻存 ,不同时间复苏 ,检测细胞活性 ,CD3 4阳性比率 ,及CFU GM数 ,分析冻存效果。结果　冻存半年 ,液氮和 -80℃对于干细胞的冻存无明显影响 ,用 10 %DMSO 自体血浆作冻存剂 ,于 -80℃低温冰箱保存的细胞 ,活力达 ( 95 .7 /-5 .84) % ,单个核细胞回收率 ( 92 .2 5 /-9.3 2 ) % ,CD3 4阳性细胞回收率 ( 71.73 /-2 7.0 3 ) % ,CFU -GM回收率 ( 77.89 /-12 .3 1) %。 9例患者行自体外周血干细胞移植 ,平均CD3 4阳性细胞回输量为每公斤体重 1.46× 10 7,CFU GM为每公斤体重 3 .85× 10 5,回输后患者平均 17天恢复中性粒细胞 2 .0 g·l-1以上 ,恢复血小板 5 0 g·l-1以上。结论　应用经 -80℃低温冻存的 10 %DMSO 自体血浆冻存外周血干细胞进行自体移植是简单可行的。     

异基因冻存外周血干细胞加骨髓移植治疗白血病

目的 探讨异基因外周血干细胞加骨髓移植的临床疗效与急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生情况.方法 对AMLL患者以其妹冻存外周血干细胞和骨髓联合移植,并观察疗效和并发症发生情况.结果 患者造血恢复良好,患者移植后为(+)19天中性粒细胞数＞0.5×109/L,+30天Plt数＞50×109/L.无aGVHD情况.结论 冻存外周血干细胞加骨髓移植是白血病有效的治疗方法,值得进一步探索.     

不同冻存条件对小鼠MA737乳腺癌移植生长的影响

选用适合的冻存条件贮存肿瘤标本可为“SRC”实验中有计划顺应时机提供标本。本文介绍了采用小鼠MA737乳腺癌标本经过4℃/24小时,-20℃/72小时,-80℃/72小时冻存处理后再移植到近交系小鼠体内观察生长情况和用0.02％苔盼蓝染色计算细胞存活率的试验分析了其影响因素和与“SRC”实验结果的关系。实验结果发现新鲜肿瘤标本和经4℃/24小时冻存处理的肿瘤标本其生长情况和细胞存活率的比值均无明显差别,病理形态无变化。经-20℃/72小时和-80℃/72小时冻存处理的标本结果次之,尤其是-20℃/72小时试验组的标本病理形态观察还发现细胞肿胀、胞浆变性变化。冻存标本时加入保护剂后的细胞对0.02％苔盼蓝染色后的N/A值明显高于不加保护剂的标本。     

ERCC1在鼻咽癌组织中的表达及其与顺铂化疗敏感性的关系

目的: 用自制的改良细胞冻存液冻存树突状细胞（dendritic cells,DCs）,观察冻存复苏后DCs的细胞存活率及体外诱导CIK(cytokine induced killer cell)对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：从外周血分离、培养获得DCs,分别用3种冻存液冻存:（1）含10%二甲基亚砜(DMSO)、20%牛血清的RPMI 1640培养液;（2）日本ZENOAQ公司的Cellbanker细胞冻存液;（3）自制细胞冻存液（含DMSO、羟乙基淀粉及细胞稳定剂）。每组DCs分6管,于-80 ℃和-196 ℃各冻存3管,分别于冻存后第30、60和180 d复苏,用锥虫蓝染色法测定细胞存活率,用MTT法检测冻存复苏后DCs活化的CIK对K562细胞的杀伤活性。结果：每组3种冻存液冻存的DCs随着冻存时间的延长,冻存复苏DCs的存活率和活性均有轻度下降,但经统计学分析3种冻存液的冻存效果无明显差别。结论：自制的改良细胞冻存液能够替代传统冻存液和进口冻存液用于DCs的冻存,有良好的推广前景     

一种冻存细胞新方法的建立

目的为寻找一个对贴壁生长细胞的短时间冻存方法,便于工作中以十分便捷的方式随时冻存和复苏该细胞.方法应用含有二甲基亚砜的常规冻存液平铺于贴壁细胞的表层,4℃降温使二甲基亚砜充分进入细胞内,之后-80℃冻存的方法对AZGY、Anip-973、SPC-A1、MKN-45、HePG2、和BGC-823六株人腺癌细胞进行了一个月和六个月的冻存与复苏的尝试.结果六株人腺癌细胞在一个月和六个月冻存、复苏后其细胞能正常生长、增殖.结论能用此方法对贴壁生长细胞进行短期冷冻保存.     

人冻存脐血移植的裸鼠模型

探讨长期深低温冻存脐血的移植活性及干细胞在裸鼠体内的迁移规律。方法选取３０只ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ裸鼠,随机分为３组。经致死量放射线照后分别给予裸鼠人冻存后脐血单个核细胞,新鲜脐血以及生理盐水外周静脉输入,观察并比较小鼠存活情况和移植存活证据,采用ＰＣＲ法及流式细胞术检测干细胞在小鼠体内的迁移,定居情况。结果冻存脐血组小鼠存活率及存活时间均显著高于生理盐水组,而与新鲜脐血组无显著性差异。ＰＣＲ法及流式细     

-80℃直接冷冻保存造血干细胞移植治疗恶性血液病

:[目的]探讨 -80℃直接冷冻保存自体造血干细胞移植(APBSCT)治疗恶性血液病的疗效。[方法]ABSCT5例 ,移植前采用粒细胞集落刺激因子(G CSF)动员外周血干细胞(PBSC) ,分离后 ,将采集的PBSC分袋直接置于 -80℃冰箱冷冻保存。[结果]PBSC短期冻存后检测回收率和台盼蓝拒染率均在80%以上 ;接受移植的5例患者均获成功 ,并持续缓解(CCR) ,中位CCR时间为18(5～31)个月 ,无复发。[结论] -80℃直接冷冻短期保存PBSC具有良好效果 ;具有简单、方便、费用低等优点 ;ABSCT造血重建快并发症少 ,值得进一步推广     

非程控降温—80℃冷冻保存外周血干细胞及应用研究

目的 为外周血造血干细胞（PBSC）的冷冻保存建立简便，经济且有效的方法并应用于临床。方法 采用6．25％二甲基亚砜（DMSO）加7．5％右旋糖酐（DEX）为冷冻保护剂，将21例恶性血液病患者行干细胞动员，采集获取的PBSC浓集液与细胞冻存液混合，不同程控降温而直接将分装后的混悬液和小样本保存于－80℃冰箱中。于冻存前和冻存后1周，1个，3个月和6个月时分别取样分析，检测细胞回收率和台盼蓝拒梁率。结果 冻存1周和1个月其细胞回收率和存活率无明显差别（P＞0．05），冻存至3个月时细胞活性及CD34^ 细胞回收率明显降低（P＜0．01），但不随同存期延长而进行性下降。19例移植患者输注保存后的PBSC均获得造血重建。结论 非程控－80℃冷冻技术是一种简便，经济和有效的造血干细胞冻存方法，且能很好地保存PBSC的造血潜能。     

人外周血树突状细胞的诱导培养及冻存

目的：探讨人外周血树突状细胞（DC）的诱导培养及冻存方法和意义。方法：通过树突状细胞的分离和培养、抗原标本前处理、抗原的装载、实验分组、细胞冻存等，摸索出树突状细胞诱导扩增以及促进成熟的优化实验方案。结果：外周血单个核细胞可作为DC的来源，GM—CSF和IL-4可诱导其前体细胞向DC分化，添加促成熟细胞因子可以让细胞维持细胞生物活性。结论：人外周血DC细胞的诱导培养及冻存具有重要意义。冷冻DC细胞保持了它的特性，但会因冻融过程生物特性有所减低，为此在应用冻存DC细胞时应考虑增加输入细胞量。     

体外培养人肺腺癌细胞液氮冻存及复苏培养

将离体细胞在实验室中进行长期培养,建立体外实验模型的组织培养技术,已广泛应用于基础医学科学的研究。培养细胞的保种则是细胞株/系建立后的一个重要问题。组织培养中常用传代培养法和低温冻存法。比较而言,前者不仅耗费了大量人力、物力、而且难以避免微生物污染等意外,甚至发生细胞生物学特征的改变。为此,我们对几个细胞系进行液氮低温(—196℃)冻存。现将液氮中成功冻存4年的高转移性人肺腺癌 Anip—973细胞系的冻存及复苏培养情况简介如下。     

外周血干细胞CD+34/CD-38亚群与集落形成能力的相关性分析

目的探讨外周血干细胞亚群CD34+/CD38-与CFU-GM,BFU-E的相关性及其影响因素.方法应用流式细胞仪测定外周血干细胞冻存前后的CD34+及CD34+/CD38-,对冻存前后的PBSC进行CFU-GM,BFU-E测定.对数据进行对比分析及相关性分析.结果冻存后较冻存前集落产率明显降低(P＜0.05),而冻存1个月与3个月的集落产率差异无显著性(P＞0.05).冻存前后CD34+/CD38-百分率与CFU-GM、BFU-E的数目相关性分析显示二者均存在显著相关性.结论外周血干细胞CD34+/CD38-百分率与CFU-GM,BFU-E集落产率之间存在显著相关性,二者可作为测定PBSC质与量的互补指标.冷冻保存时间对PBSC的膜分子抗原无明显影响.冷冻保存减少了CFU-GM,BFU-E的产率,但冻存1个月与3个月对PBSC的集落产率影响不明显.     

低温保护冻存的异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的研究

目的 观察经低温冻存的异体骨软骨移植物中软骨细胞的存活情况，并对比两个不同处理组移植物修复关节软骨缺损的效果。方法 将一组移植物的关节软骨造孔，另一组不造孔，二者均经低温冻存后，用于修复关节软骨缺损，通过大体观察、组织学观察、移植物退变评分及氨基酸分析等多种方法对修复效果进行评估。结果 经冻存后两处理组的移植物中仍有一定数量的软骨细胞存活；造孔处理组在存活软骨细胞数目、移植物退变程度等方面较对照组显示出优势。结论 低温冻存异体骨软骨移植是修复关节软骨缺损行之有效的措施，造孔处理可以改进移植修复的效果。     

脐血来源树突状细胞的体外扩增、鉴定及冻存

目的研究脐血来源树突状细胞（DCs）的体外扩增、鉴定和冻存。方法用Ficoll分离获得脐血单个核细胞，以重组hGM—CSF、hIL-4及hTNF-α体外诱导培养14d。在DCs发育过程中，在光镜和电镜下观察其生长情况，应用流式细胞仪检测DCs表型。采用台盼蓝拒染法测定DCs增殖水平，MTT法检测DCs活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤性。同时用二甲亚砜作为保护剂，DCs经过-20℃和-80℃降温，在-196℃液氮保存，然后40℃水浴复苏。结果第6天体外培养的DCs由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞，随着培养时间的延长，此类细胞数量增多，第14天为形态不规则的毛刺状，为典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明，成熟DCs高水平地表达HLA—DR、CD80、CD83、CD1a、CD11c。被激活的T细胞对2种来源于不同组织的肿瘤细胞均产生了明显的杀伤性。冻存DCs和新鲜DCs的生物活性无明显差异。结论脐血单个核细胞细胞经hGM—CSF＋hIL-4＋hTNF—α体外培养，能诱导出DCs，为进一步开展DCs的实验研究与临床应用奠定了基础。     

超低温对淋巴细胞转化的影响

研究分析超低温冻存前后外周血淋巴细胞（ＬＣ）的转化活性改变。结果发现，冻存后Ｔ淋巴细胞（ＴＬｃ）对植物凝集素（ＰＨＡ）刺激反应迟缓，转化率减低（冻前７２小时为６６．１９％，冻后７２小时为４８．９３％），延长培养时间（９６小时）可使部分细胞功能得以恢复，但仍不能达到冻前水平（冻前６５．６９％，冻后５８．２％）。冻存后ＴＬＣ转化中的母细胞型和分裂型百分比率下降明显，前者由３８．３２％减至２３．４８％，后者由１．２９％减１０．３６％。说明超低温冻存可影响ＴＬＣ内蛋白质和核酸合成。对Ｂ淋巴细胞（ＢＬＣ）影响不明显。     

冻存自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病

近年来,自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)作为根治血液系统恶性疾病的方法得到了飞速发展.     

—80℃直接冷冻保存造血干细胞移植治疗恶性血液病

「目的」探讨－８０℃直接冷冻保存自体造血干细胞移植（ＡＰＢＳＣＴ）治疗恶性血液病的疗效。「方法」ＡＢＳＣＴ５例，移植前采用粒细胞集落刺激因子９Ｇ－ＣＳＦ）－动员外周血干细胞（ＰＢＳＣ０，分离后，将采集的ＰＢＳＣ分袋直接置于－８０℃冰箱冷冻保存。「结果」ＰＢＳＣ短期冻存后检测回收率和台盼蓝拒染率均在８０％以上；接受移植的５例患者均获成功，并持续缓 位ＣＣＲ时间为１８（５￣３１）个月，无复发。「结论」     

不同冻存时间对CIK细胞免疫表型及杀伤活性的影响

目的:探讨不同冻存时间对外周血来源的CIK细胞免疫表型及其杀伤活性的影响。方法:采集6名健康患者外周血,分离外周血单个核细胞培养,第0h加入IFN-γ,24h后加入IL-2、抗CD3单抗,每隔3天补充含CD3单抗、IL-2的新鲜培养液,培养15天进行冻存。复苏冻存1、2、3、4、5月的CIK细胞为实验组,以常规培养至15天的CIK细胞为对照组。利用流式细胞仪检测各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞的百分比,CCK8法检测各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:冻存1、2、3月的CIK细胞与对照相比CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例无明显差异（P＞0.05）,冻存4、5月的CIK细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较对照组明显下降［（70.62±6.35）%、（14.36±4.28）%、（67.87±5.63）%、（12.61±6.21）% vs （84.23±5.20）%、（22.75±3.46）%］,P＜0.05。对靶细胞的杀伤能力在1、2、3月时与对照相比未见明显减弱（P＞0.05）,冻存4月、5月后的CIK细胞在各效靶比对K562细胞的杀伤活性与对照相比明显减弱（P＜0.05）。结论:冻存时间的长短对CIK细胞的免疫表型及杀伤活性均有一定的影响,且随着冻存时间的延长,CIK细胞的杀伤活性减弱。建议冻存CIK细胞的最佳时间为1、2和3月。     

程控冷冻对造血干细胞及淋巴细胞不同亚群的影响

外周血造血干细胞移植联合大剂量化疗已成为目前某些恶性肿瘤根治性治疗手段,而干细胞体外冷冻技术为其关键之一。目前国内外有关超低温冷冻对造血干细胞及不同淋巴结亚群存活的影响是否相同的报道少见。本研究采用程控降温系统将从外周血采集的单个核细胞(PBMC）逐步降温至－80℃并保存于－196℃液氮中,复苏后对细胞活性进行评价。1 材料与方法34例实体瘤患者中,乳腺癌15例,恶性淋巴瘤14例,卵巢癌3例,生殖细胞肿瘤1例,肺癌1例。年龄30～55岁。使用美国百特公司血细胞分离机(CS－3000Plus）采集PBMC。每份样本的冻存体积为60ml…     

强化疗加自体骨髓移植治疗17例恶性肿瘤的体会

对17例恶性肿瘤患者进行了以化疗为预处理方案的自体骨髓移植。除第1例为全髓冷冻保存外,其余患者的骨髓有核细胞经程控降温后置于-196℃液氮中行深低温冻存。结果:除1位患者于 7天死于急性左心衰外,余16例均获成功。     

自体外周血造血干细胞(APBSC)动员采集及冻存的研究

目的评价自体外周血造血干细胞(APBSC)的动员、采集及冻存方法。方法18例病例中，恶性淋巴瘤16例(NHL14例，HD2例)，睾丸肿瘤2例。病人行诱导化疗完全缓解后，采用大剂量联合化疗加小剂量粒细胞集落刺激因子(G—CSF)进行外周造血干细胞动员。用CS-3000，Plus血细胞分离机采集外周血造血干细胞，将分离的单个核细胞(MNC)经程序降温仪降至-80℃后，冻存-196℃液氮。冷冻前及解冻后分别行MNC计数和粒单系祖细胞集落(CFU—GM)培养。结果动员后外周血WBC及MNC总数明显增加，与动员前比较，差异有显著性。冷冻前后，MNC计数，CFU—GM集落数无明显差异。结论大剂量联合化疗加小剂量G—CSF动员方案是安全有效的。冷冻保存APBSC及复苏过程对细胞损伤较小，值得推广使用。