真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达☆

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。 目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。 方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经Bam HI、Xho Ⅰ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。 结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

PYGO2基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建PYGO2基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法以PYGO2为靶基因,以pSUPER．puro质粒为载体,设计构建重组体,根据基因库（GenBank）提供的PYGO2基因核苷酸序列,在http：／／www．ambion．com网站上使用siRNA Target Finder软件进行目的基因的siRNA序列对应DNA的设计与筛选,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pSUPER．puro中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pSUPER．puro-PYGO2质粒转染胶质瘤C6细胞48h,检测其对该细胞PYGO2蛋白的影响。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低胶质瘤细胞PYGO2的蛋白表达,重组载体构建成功。结论利用RNAi技术可成功构建抑制PYGO2表达的siRNA真核表达载体。     

大鼠半乳凝素9基因克隆及真核表达载体的构建

背景：研究提示,半乳凝素9在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控方面发挥作用,但其作用机制尚不明确。 目的：克隆大鼠半乳凝素9基因片段,构建pDC316-GFP-Galectin-9真核表达质粒,以进一步了解半乳凝素9各种功能和反应机制, 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-11/2009-01在北京本元正阳基因技术有限公司完成。 材料：SPF级雄性Lewis大鼠1只。 方法：采用反转录聚合酶链反应技术,从大鼠肝脏组织中扩增出大鼠半乳凝素9基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组到pDC316-GFP真核表达载体上,构建pDC316-GFP-Galectin-9重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。 主要观察指标：重组质粒的鉴定结果。 结果：总RNA经RT-PCR扩增后,经琼脂糖凝胶电泳,在1 kb下方可见一条明显扩增的条带,与预计的半乳凝素9-cDNA长度相符。重组质粒经NotⅠ/HindⅢ双酶切和未作酶切的重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9一起经琼脂糖凝胶电泳,前者出现了980 bp和5.8 kb 2条带(980 bp为Galectin-9-cDNA产物,5.8 kb为pDC316-GFP线状质粒),后者出现6.7 kb条带(重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9),初步表明重组质粒构建成功。测序结果用NCBI上的BLAST进行比对分析,其核酸序列与GeneBank中的半乳凝素9的mRNA的编码序列(NM_012977)同源性完全相符,进一步证实所克隆的基因为大鼠半乳凝素9-cDNA。 结论：成功克隆了半乳凝素9基因并构建成其真核表达质粒。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)tPA的构建

目的 构建一种无形成病毒及激活原癌基因可能的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔＰＡ,以探讨其对纤溶活性影响。方法 用分子克隆方法,将人ｔＰＡｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）重组,并对重组质粒进行ＤＮＡ测序,结果 重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔＰＡ经ＫｐｎＩ和ＸｂａＩ酶切后,出现了５．４ｋｂ与２．０ｋｂ两个片段,经ＰｓｔＩ酶切后出现了７８ｂｐ,６２２ｂｐ,２．０ｋｂ及４．２ｋｂ五个片     

重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：目前报道的重组腺病毒构建方法较复杂,构建周期长,导致重组腺病毒构建的成功率较低。GatewayTM技术是基于λ噬菌体的位点特异性高效重组系统,其构建重组病毒载体具有快捷高效的特点。 目的：构建含人骨形态发生蛋白2 基因的重组腺病毒载体,为应用骨形态发生蛋白2 基因治疗的研究奠定基础。 设计、时间及地点：单一样本观察,实验于2008-02/06在深圳市第二人民医院中心实验室完成。 材料：pOTB7-BMP-2 质粒、HEK293为ATTC产品;BLOCK-iTTM Adenovirus Expression System为Invitrogen产品;大肠杆菌DH5α为Biontex产品。 方法：用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白2 目的基因,并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析。将骨形态发生蛋白2 基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1(+)中,构建pEC3.1-BMP-2 穿梭质粒,再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iT™-DEST腺病毒载体中,线性化后转293 细胞进行包装获得重组腺病毒rAd-BMP2。 主要观察指标：①目的基因骨形态发生蛋白2 的聚合酶链反应扩增。②重组质粒TS-BMP2 的构建。③重组pEC3.1-BMP2 的构建。④重组pAd-BMP2 的构建。⑤重组腺病毒的制备与鉴定。 结果：正确扩增长约1.2 kb的骨形态发生蛋白2 cDNA,并成功地构建其腺病毒载体,经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞,包装、扩增后得到人骨形态发生蛋白2 重组腺病毒(rAd-BMP2),其滴度约为1×1010 PFU/mL,该滴度可满足进一步的骨形态发生蛋白2 成骨作用的研究。 结论：成功地构建重组人骨形态发生蛋白2 腺病毒载体。     

增强型绿色荧光蛋白-神经标识真核表达载体构建及在细胞内的表达

目的 构建可转染神经胶质细胞和神经元的增强型绿色荧光蛋白-神经标识(EGFP-ID)真核表达载体,为神经突起损伤活体研究提供技术方法. 方法 采用PCR方法分别从质粒pEGFP-N1载体和大鼠脑组织基因组DNA中扩增EGFP和ID序列.通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物EGFP与经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的pcDNA4.1-hisB载体连接.将经克隆测序确定的pcDNA4.1-EGFP经由NotⅠ和Xba Ⅰ双酶切并与纯化的PCR产物ID连接,再次克隆测序确定为pcDNA4.1-EGFP-ID.将pcDNA4.1-EGFP与pcDNA4.1-EGFP-ID在转染试剂Fugene6 介导下转染人神经胶质瘤U87细胞和小鼠原代培养神经元,通过倒置荧光显微镜观察EGFP在2种细胞内的分布.此外,用50 μmol/L核苷类似物司他夫定处理神经元8d,第8天末观察EGFP-ID 示踪细胞突起发育情况,并与免疫荧光检测结果作比较. 结果 成功扩增得到EGFP和ID基因片段,重组得到EGFP-ID真核表达载体,该载体携带的EGFP基因在U87细胞和神经元内表达并布满细胞突起,示踪神经元突起形态变化的结果与免疫荧光观察结果一致. 结论 pcDNA4.1-EGFP-ID能够介导EGFP基因在神经元和胶质细胞突起内表达,从而直观再现神经突起形态特征.     

人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达

目的构建含人AChRα1亚单位胞外段(Hα1-210)-IgG1Fc融合基因的真核表达载体,表达人AChR-Fc融合蛋白。方法扩增Hα1-210基因,插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210,并经酶切、测序鉴定;采用脂质体法将重组载体转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选、ELISA检测,挑选高表达融合蛋白的阳性转化子扩大培养;表达的AChR-Fc融合蛋白经Protein A亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果酶切及测序结果证实Hα1-210基因序列正确,真核表达载体pAN-Hα1-210构建成功;ELISA检测证实AChR-Fc融合蛋白在细胞培养上清中呈分泌表达;SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的相对分子质量约为51 000;Western blot结果显示该融合蛋白能被特异性单克隆抗体mAb198所识别。结论成功构建pAN-Hα1-210真核表达载体,并获得具有生物活性的AChR-Fc融合蛋白,为进一步开展融合蛋白靶向B细胞治疗重症肌无力的研究奠定了基础。     

白细胞相关免疫球蛋白样受体2(CD306)真核表达载体构建及蛋白的纯化与鉴定

背景：目前国内外对白细胞相关免疫球蛋白样受体(leukocyte-associated immunoglobulin like-receptor, LAIR)家族中LAIR 1的生物学功能研究已较清晰,而关于LAIR-2分子在机体内的生物学功能尚缺乏相关报道。 目的：为进一步研究LAIR-2的体内生物学功能,构建其真核表达载体,纯化并鉴定蛋白。 设计、时间及地点：单一样本观察实验,于2007-06/2008-06在解放军第四军医大学完成。 材料：载体pIg/3c由英国牛津大学徐小宁博士惠赠。载体pcDNA3.1由荷兰Meyaard博士惠赠。中国仓鼠卵巢细胞系CHO由解放军第四军医大学免疫学教研室冻存。 方法：构建pIg/3c-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2两个真核表达载体,电转染法转染CHO细胞建立稳定表达LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全长蛋白分子的细胞株,通过Western blot、细胞免疫化学、流式细胞术分析实验鉴定真核表达LAIR-2蛋白分子与抗原核表达LAIR-2 mAbs的结合活性。 主要观察指标：稳定转染细胞系的建立及真核表达蛋白的纯化和鉴定。LAIR-2蛋白与相应单克隆抗体的结合活性。 结果：构建真核表达载体并成功转染CHO细胞,建立稳定分泌LAIR-2-Fc融合蛋白的转染细胞系及稳定分泌LAIR-2蛋白的转染细胞系,分别命名为CHO/LAIR-2-Fc以及CHO/LAIR-2。Western blot实验表明真核表达的LAIR-2全长蛋白分子均可与三株抗LAIR-2 mAb 1A7、3H12及4A9发生特异性结合反应。免疫细胞化学、流式细胞术分析实验结果表明抗原核细胞表达蛋白的三株LAIR-2单克隆抗体中,1A7不能结合pcDNA3.1-LAIR-2转染的CHO细胞内的LAIR-2,面3H12和4A9均可以很好结合细胞内的LAIR-2。 结论：实验成功构建了pIg/3c-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2两个真核表达载体,成功转染CHO细胞并建立稳定表达LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全长蛋白分子的细胞株。真核表达的LAIR-2蛋白分子与抗原核表达的LAIR-2 mAbs有良好的结合活性。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-p16的构建及其在胶质瘤细胞C6内的表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达.方法 用PCR的方法扩增p16基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,经BamH I及Xho I双酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染C6细胞,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,用免疫组化染色的方法检测细胞中p16的表达.结果 成功地构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,用脂质体法转染神经胶质瘤细胞C6后,经荧光显微镜和免疫组化染色法检测,可见细胞内有EGFP及p16的表达.结论 成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,并在神经胶质瘤细胞C6中表达,为研究p16对肿瘤的生物学作用以及p16在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-p16,and to express p16 in glioma cell C6. Methods The p16 gene was amplified by PCR using pCMV5-HA-p16 as a template,and confirmed by DNA sequencing. The eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-p16 was constructed by introducing p16 DNA fragment into the sites of BamH I and Xho I of pIRES2-EGFP vector. The plasmid was transfected into the C6 cells using lipofectamine. The expressed EGFP was observed under fluorescent microscope and the P16 protein expression was detected by immunostaining using anti-P16 antibody. Results The eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-p16 was constructed and transfected successfully into C6 glioma cells. The green fluorescence of EGFP was observed in the plasma and nuclei of transfected cells, and P16 protein was found in the plasma and nuclear. Conclusion The recombinant expression vector pIRES2-EGFP-p16 was constructed, and the EGFP and p16 gene could be co-expressed in the C6 cells. This study laid a foundation for the further research of the function of p16 in cell differentiation, growth and tumorigenesis.     

构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定

背景：胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用。 目的：对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-09/11在上海市长征医院神经外科实验室完成。 材料：中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega 公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存。 方法：从人脑胶质瘤组织提取mRNA, 采用反转录-聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。 主要观察指标：总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定。 结果：抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带。且总RNA的A260nm/A280 nm值为1.903。聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致。重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白。 结论：用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。     

新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测

背景：骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道。目的：构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用。方法：根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。结果与结论：pDNR-CMV-BMP2质粒SalI和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72 h细胞抑制率无明显差别(P > 0.05),转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达。结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定*☆

背景：FasL通过与靶细胞上Fas结合诱导程序性细胞死亡,可维持机体内稳态,诱导同种异基因移植免疫耐受,促进肿瘤细胞凋亡。目的：构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因hFasL的真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL。方法：通过实时聚合酶链反应RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出hFasL基因,与真核空载体 plRES2-EGFP一起,经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接,从而构建pIRES2-EGFP-hFasL。用紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度,经酶切、PCR技术、基因测序等方法进行鉴定。结果与结论：扩增出的hFasL条带大小约846 bp,构建的plRES2-EGFP-hFasL经酶切后在846 bp和2 000 bp处有特异性条带,DNA测序证实hFasL与Genebank上的序列完全一致。提示成功构建了含有hFasL及EGFP的真核表达载体plRES2-EGFP-hFasL。     

双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP-2的构建及鉴定

背景：骨形态发生蛋白等因子及以其为中心构建的支架或载体已经广泛应用于实验研究中,并逐渐应用于临床,然而,治疗效果的示踪方法为实验提出了挑战。增强型绿色荧光蛋白基因的发现和应用解决了这一难题。目的：构建双顺反子真核表达载体PIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2,检测其表达情况。方法：利用RT-PCR方法从人骨肉瘤组织中提取人骨形态发生蛋白2基因,使之与PMD18-T载体连接,经酶切回收后,与目的载体pIRES2-增强型绿色荧光蛋白连接。用PCR技术及基因测序鉴定构建结果。然后将构建好的载体转染人胚肾293细胞,通过荧光显微镜及Western blot技术观测其表达。结果与结论：实验成功扩增了人骨形态发生蛋白2基因并构建了pIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2载体,将pIRES2-EGFP-hBMP-2用脂质体转染入人胚肾293细胞后48 h,荧光显微镜观察约30%细胞发出绿色荧光,Western blot结果发现在Mr46×106处有一特异性骨形态发生蛋白条带,表明所构建载体中靶基因能成功表达。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定

背景：内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法。 目的：实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定。 方法：用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2。 结果与结论：phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体。     

含GDNF基因真核载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建含GDNF基因真核表达载体,并分析其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法从SD大鼠脑中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增GDNF基因,测序鉴定后将GDNF基因克隆入p CDNA3.1中,构建真核表达载体p CDNA3.1-GDNF;原代培养大鼠间充质干细胞,以脂质体介导法将构建好的真核表达载体p CDNA3.1-GDNF转染至间充质干细胞;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测GDNF在间充质干细胞中的表达。结果扩增的大鼠GDNF基因序列与Gen Bbank的参考序列完全一致,GDNF基因已经正确克隆到真核表达载体p CDNA3.1中;转染骨髓间充质干细胞4 h后,GDNF的mRNA和蛋白能在细胞中正确表达。结论 p CDNA3.1-GDNF真核表达载体构建成功,并能在大鼠间充质干细胞中正确表达,这为下一步研究携带GDNF的骨髓间充质干细胞治疗癫痫奠定了实验基础。     

人NR2B基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人NR2B基因,构建其真核表达载体,获得暂态表达NR2B的CHO细胞.方法 RT-PCR方法克隆人NR2B基因,并插入真核表达载体pcDNA3.1中,将该重组载体转染至CHO细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光鉴定细胞中NR2B的表达,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 成功获得人NR2B基因,转染的CHO细胞可检测到NR2B的表达,表达NR2B的CHO细胞并不会凋亡.结论 成功克隆和构建了人NR2B基因的真核表达载体,并在CHO细胞中得到了表达.