丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的：阐明丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(NS5A)反式激活基因NS5A-TP9表达的调控机制。方法：选取NS5A-TP9基因翻译起始密码子ATG上游661bp的基因组DNA序列作为启动子序列，应用聚合酶链反应(PCR)技术，以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至pCAT3中，构建pCAT3-NS5A-TP9-promoter报告基因表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：发现质粒pCAT3-NS5A-TP9-promoter具有指导报告基因CAT转录表达的启动子活性，CAT的吸光度(A值)是缺乏启动子序列对照质粒pCAT3的13．9倍。结论：本研究克隆的启动子DNA序列具有指导下游基因转录的启动子活性，这一结果为研究新基因NS5A-TP9转录表达的调节机制，进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的作用机制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4的克隆化研究

目的 探索丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白反式激活作用的新的靶基因，以有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 应用表达谱芯片分析等分子生物学技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术，筛选、克隆HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3-core，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3-core转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆核心蛋白反式激活的新型靶基因，命名为HCTP4，新基因的编码基因序列全长为220个核苷酸(nt)，编码产物由748个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV核心蛋白是具有反式激活作用的蛋白。DNA微短阵技术(DNA mieroarray)是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因，此新基因的发现为深入研究HCV核心蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒核心蛋白6号结合蛋白基因启动子序列的确定及转录活性鉴定

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白6号结合蛋白基因（Hcbp6）序列表达的调控机制。方法根据软件对启动子的预测，选取翻译起始密码子ATG上游3256bp及下游180bp的DNA序列，分成5段活性区域，分别以聚合酶链反应技术（PCR），肝母细胞瘤细胞系HePG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至PCAT3中，构建PCAT3-Hcbp6-P报告基因表达载体，将该质粒分别转染HePG2，NIH3T3细胞，用酶联免疫吸附法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果发现质粒pCAT3-Hcbp6-1066p和pCAT3-Hcbp6-240p能够指导CAT的表达，其平均吸光度值（4）是PCAT3-basic对照质粒的3．1倍和6．4倍。结论本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性，这一结果为研究HcbP6的调节机制，进一步阐明HCV核心蛋白的作用机制奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，探索HCTP4基因的表达调控机制。方法：应用噬菌体表面展示技术，以多聚酶链反应(PCR)技术扩增的HCTP4启动子DNA片段作为固相筛选分子．对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物并进行克隆化，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆。成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合的蛋白有：核糖体蛋白L15、视网膜母细胞瘤结合蛋白8。结论：用噬茵体人肝cDNA文库筛选得到HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究HCTP4的生物学调节机制，进一步阐明HCV核心蛋白的致病机制奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法：应用噬菌体展示技术，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物构建克隆载体，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出10个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有：补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制，进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列，对其可能的氨基酸序列进行分析比较，并对其基因利用多聚酶链反应技术(PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现，为阐明HCVV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因2的克隆化研究

目的：对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)蛋白反式激活靶基因2(NS5A-TP2)的基因作克隆化研究。方法：依据我室构建的HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果，利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因NS5-ATP2的编码序列，对其氨基酸序列进行分析比较，并对其进行克隆化研究。结果：NS5A-TP2基因编码区为615核苷酸(nt)，编码产物为204氨基酸残基(aa)。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻，与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性，说明我们克隆的NS5A-TP2基因属于未知功能新基因。结论：发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为研究新基因的生物学功能及慢性丙型肝炎发病机制提供新的思路。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A调节新生多肽复合物启动子转录活性的研究

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对新生多肽相关复合物（NACA）启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3．1（-）-NS5A质粒和含有NACA基因启动子的PCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组，同时PCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3．1（-）-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较，共转染组A值下降了79．3％。结论HCV NS5A能够抑制NACA启动子的活性，对NACA的表达具有下调作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCV NSSA表达质粒peDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行SSH分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对，进行电子拼接。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。结果 结果从HepG2细胞提取总RNA，多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，测序证实，命名为NSSATP8在GenBank中注册，注册号为．AF529369.NSSATP8基因的编码序列全长为1449(nt)，编码产物由483个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV NS5A反式激活新型靶基因NSSATP8筛选与克隆，进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法：以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-pre-S1转染HepG2细胞．以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果：对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白2(PS1TP2),已在GenBank中注册,注册号：AY426673。PS1TP2基因的编码序列全长为573个核苷酸(nt),编码产物由190个氨基酸残基(aa)组成。结论：HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的免疫应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究

目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染了pcDNA 3.1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740520.该基因的编码序列全长为1 344个核苷酸(nt),编码产物由448个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶中核糖核酸酶RNase H反式调节基因DNAPTP4的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)核糖核酸酶RNaseH蛋白反式激活基因差异表达的cDNA,克隆RNaseH反式激活相关靶基因。方法以RNaseH表达质粒pcDNA31(-)RNaseH转染HepG2细胞,以空载体pcDNA31(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,其未知基因片段通过Kozak规则和多聚腺苷酸信号序列,初步确定。以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实。结果该新基因被命名为DNAPTP4,在GenBank中注册,注册号为AY450392。DNAPTP4基因的编码序列全长为828个核苷酸(nt),编码产物由276个氨基酸残基(aa)组成。结论应用SSH技术成功筛选与克隆RNaseH反式激活新型靶基因DNAPTP4,为进一步阐明RNaseH反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6猴同源基因N的克隆化与序列分析

目的：利用酵母双杂交技术，业已成功克隆了人类丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的编码基因。为了阐明不同生物类型中HCBP6基因序列的同源性，阐明HCBP6的生物学功能，我们应用生物信息学技术，克隆猴HCBP6同源基因序列，并对其结构进行分析。方法：应用我们克隆的人HCBP6基因序列作为参照，对美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程信息中心(NCBI)建立的核苷酸数据库以及在线分析软件进行分析。对已经克隆的不同生物来源的HCBP6的同源基因序列进行比较。结果：猴HCBP6的同源基因开放读码框架长度为570bp，编码产物HCBP6蛋白由189aa组成。猴HCBP6的同源基因编码产物与人、猪、牛的HCBP6同源基因编码产物的同源性分别是96．27％、89．95％、85．7l％。结论：生物信息学技术是克隆不同生物类型的同源基因序列的可靠、快捷途径。猴HCBP6同源基因的克隆化为研究不同种属来源的HCBP6基因的结构域功能、表达与调控等研究奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCV NS2蛋白的反式调节基因.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)-NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析.结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α-2-HS-糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled-coil-helix结构的新蛋白、未知功能基因.结论:成功构建HCV NS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索.     

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的：寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白，进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用，阐明其分子作用机制。方法：应用酵母单杂交体系，以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”，对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选，应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果：共获得了12个双阳性克隆，编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白，其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论：这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合，可能是作用于SPⅠ的反式作用因子，但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用，笔者正进行进一步的研究。