成纤维细胞生长因子受体4研究进展

成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)是成纤维细胞生长因子受体家族成员之一,在细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤与修复中发挥着重要的调控作用。FGFR4在不同个体中存在遗传多态性,这种遗传多态性影响其结构与功能,与乳腺癌等人类疾病的发生发展密切相关。综述FGFR4基因结构、功能以及FGFR4在人类疾病发生发展中的作用及可能机制,对指导临床治疗有积极作用。     

碱性成纤维细胞生长因子及成纤维细胞生长因子受体在豚鼠前 …

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）及成纤维细胞生长因子受体（ＦＧＦＲ）在豚鼠前庭终器的定位和表达。方法：免疫组织化学。结果：ｂＦＧＦ位于支持细胞和毛细胞的胞浆及胞核，ＦＧＦＲ位于支持细胞表面。ｂＦＧＦ及ＦＧＦＲ在成年豚鼠表达较弱，新生豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠表达较强。结论：提示ｂＦＧＦ在豚鼠前庭终器发育、结构功能维持及损害及修复中起重要作用。     

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能     

大鼠SOCS3腺病毒的构建及鉴定

目的:构建大鼠细胞因子信号途径抑制物3(SOCS3)腺病毒载体,并对腺病毒感染后的HEK293细胞的SOCS3表达情况进行观察。方法:提取大鼠腹腔巨噬细胞中总RNA,克隆出SOCS3基因,亚克隆于含有GFP报告基因的穿梭质粒pAdtrack-CMV,通过pAdeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭质粒和骨架质粒共转入BJ5183感受态细胞。线性化重组的病毒转染入HEK293细胞,并在其中对重组的腺病毒进行包装及扩增。结果:构建的大鼠SOCS3腺病毒能够高效率的感染HEK293细胞,mRNA和蛋白水平均证实SOCS3表达显著增加。结论:大鼠SOCS3腺病毒载体构建成功,可用于体内转染或细胞试验的进一步研究。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因重组腺病毒粘粒载体的构建

目的　构建人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)重组腺病毒粘粒载体。方法　抽取人胎脑组织mRNA ,经RT PCR获取aFGF基因 ,测序后将其插入腺病毒粘粒载体 pAxCAwt的SwaI位点。 结果　RT PCR合成的DNA片段经克隆、测序后证实为aFGF基因 ,酶切结果显示 ,aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)中aFGF的插入方向正确。结论　构建的aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)可用于进一步的基因治疗的研究中 ,为心肌缺血区促血管生长因子基因转染作准备     

LRIG3基因特异性siRNA腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定针对LRIG3 基因的小干扰RNA(LRIG3-siRNA)腺病毒表达载体,为膀胱癌基因治疗的研究提供有效的实验工具.方法 设计可形成小发夹结构的LRIG3-siRNA模板cDNA 序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pSilencer-U6neo,构建LRIG3-siRNA表达质粒pSilencer-LRIG3.鉴定正确后,将pSilencer-LRIG3转染至HEK293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒pAd-LRIG3.大量扩增pAd-LRIG3,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度.pAd-LRIG3 感染人膀胱癌细胞T24,RT-PCR法检测LRIG3 mRNA的表达.结果酶切分析、测序鉴定表明pSilencer-LRIG3构建成功,PCR分析表明pAd-LRIG3含有LRIG3-siRNA 序列.pAd-LRIG3可抑制 LRIG3 mRNA的表达.结论 含有LRIG3-siRNA 的重组腺病毒构建成功,且具有抑制LRIG3基因mRNA 表达的功能.     

成纤维细胞生长因子受体3和中枢神经系统发育

在胚胎发育过程中成纤维细胞生长因子调控细胞的增殖、迁移和分化,这些过程要通过激活其受体来完成[1],其中包括成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3).     

小鼠NLRP3基因腺病毒干扰载体的构建及功能鉴定

目的构建针对小鼠NLRP3基因的腺病毒干扰载体(Ad-NLRP3-shRNA),并在Min6和RAW264.7细胞中验证其基因沉默效率。方法针对小鼠NLRP3基因设计、合成3对NLRP3 shRNA 1-3干扰序列,重组至pHBAd-U6-CMV质粒载体。在HEK293T细胞内包装Ad-NLRP3-shRNA。感染Min6和RAW264.7细胞后,采用实时定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)检测NLRP3基因表达。结果 Ad-NLRP3-shRNA 1-3在Min6和RAW264.7细胞的干扰效率分别达到44.38%、46.61%和82.83%以及47.23%、49.59%和78.64%。结论成功构建出Ad-NLRP3-shRNA载体,为研究NLRP3基因的功能提供有效工具。     

转化生长因子-β3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的：构建含有转化生长因子-β3（Transforming growth factor-β3,TGF-β3）和增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的腺病毒载体,使其转染兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并在细胞内得到表达。方法：将含有TGF-β3基因克隆至含有EGFP的穿梭质粒,通过在感受态菌DH5α内同源重组,构建 pAdxsi-EGFP-TGF-β3。PacⅠ酶切线性化pAdxsi-EGFP-TGF-β3转染HEK293细胞,多轮“乒乓感染法”扩增收集 pAdxsi-EGFP-TGF-β3 病毒液,氯化铯梯度离心纯化,PCR和荧光显微镜观察EGFP的表达并检测重组腺病毒液的滴度。测定重组腺病毒液转染 MSCs 细胞转染效率,Western blot检测 TGF-β3 蛋白表达。结果：成功构建携带 TGF-β3和EGFP 的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3,PCR和绿色荧光证实病毒包装成功,并具有感染力,病毒滴度为 2×1010 pfu/ml。Western blot 检测表明Adxsi-EGFP-TGF-β3感染的 兔骨髓MSCs 细胞有效表达 TGF-β3。结论：含有 TGF-β3 和EGFP的腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3构建成功和TGF-β3蛋白在兔骨髓MSCs中有效表达,为进一步研究转染TGF-β3 基因的兔骨髓MSCs 减轻创面愈合后瘢痕组织增生提供实验基础。     

小鼠角质化细胞生长因子及其受体的重组腺病毒表达载体的构建

【论文特点介绍】既往研究表明角质化细胞生长因子（KGD对急性起病的ALI／ARDS，以及慢性进展的PF均有预防作用。因此，构建KGF、KGFR的重组腺病毒载体对于探索肺部疾病的治疗，探讨KGF，乃至其他生长因子在肺损伤免疫进程中的作用都是一个有力的工具。     

应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索.方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109.毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象.将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质.结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用.结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性.     

PTEN cDNA重组腺病毒载体的构建

目的:应用同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,产生重组腺病毒AdPTEN.方法:将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN cDNA中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,产生重组PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,通过脂质体介导将pAdPTEN cDNA转染至HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒AdPTEN,并测定其滴度.结果:产生具有感染能力的重组腺病毒AdPTEN,滴度约为5×109pfu/ml.结论:成功构建出含有PTEN cDNA的具有感染能力的腺病毒,并可获得较高的病毒滴度,为进一步研究PTEN基因的功能和相关肿瘤的基因治疗提供有效的基因转移载体.     

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为109PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。     

FGFR3在小鼠小肠发育阶段的作用

目的探讨FGFR3在小鼠小肠发育阶段的作用。方法观察同窝野生小鼠及FGFR3增强小鼠出生后小肠上皮形态学的变化及增生情况和FGFR3表达变化。结果FGFR3增强小鼠绒毛分布密度及绒毛高度均差于同年龄野生小鼠,但隐窝深度却是相反的。增生的细胞主要位于肠隐窝部位,FGFR3增强突变小鼠在各时相点细胞增生均强于野生小鼠。小鼠出生后1天小肠即有FGFR3表达,7~21天表达较多,35天后表达减少。免疫组化检测FGFR3表达位于肠隐窝部位,与Brdu表达信号部位相重叠。结论FGFR3在发育阶段促进小鼠肠隐窝形成。     

小鼠HSP27基因腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:为深入研究热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)的生理与病理功能,应用PAdEasy腺病毒载体系统构建带荧光蛋白的小鼠HSP27重组腺病毒,并进行鉴定.方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,通过PCR、序列测定、酶切鉴定;利用PAdEasy系统进行重组,在293细胞中包装和扩增,然后体外感染小鼠精原母细胞,Westernblot检测HSP27蛋白表达.结果:测序和酶切鉴定重组腺病毒质粒构建正确;经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获高滴度重组腺病毒体外感染小鼠精原母细胞,并且可正确表达HSP27.结论:应用PAdEasy系统重组技术成功构建了小鼠HSP27带荧光蛋白腺病毒载体,并在小鼠精母细胞系进行体外有效表达,为进一步研究HSP27的功能奠定基础.     

利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

小鼠Osf2／Cbfal基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。     

小鼠CD200基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建携带小鼠 CD200 基因的重组腺病毒载体,并鉴定其在小鼠胰腺内皮细胞（mile sven 1,MS1）中mCD200基因的表达情况。方法：mCD200 基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒pYr-adshuttle-4,获得重组质粒 pYr-ads-4-mCD200。从该重组质粒上利用LR（attL×attR）特异性同源重组的方法,将 mCD200 表达框构建至腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST上,获得的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切,转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAd-4-mCD200,并用酶切和PCR等鉴定。采用TCID 50（tissue cell infectious dosage 50,TCID50）法测定重组腺病毒滴度。同时在HEK293细胞中进行病毒扩增,并感染小鼠内皮细胞MS1,通过荧光显微镜、real-time PCR检测MS1中小鼠CD200基因的表达。结果：PCR鉴定重组腺病毒证实重组腺病毒rAd-4-mCD200 构建成功;扩增后检测病毒滴度约为109~1010 pfu/ml;荧光显微镜及real-time PCR检测发现该重组腺病毒能在MS1细胞中高效的表达。结论：构建的重组腺病毒 rAd-4-mCD200在MS1细胞中成功表达mCD200基因,为下一步开展关于CD200 基因免疫抑制调节等相关研究奠定了基础。