镉和镍恶性转化16HBE上调基因eIF3 p36的克隆与序列

目的分析镉和镍恶性转化16HBE（人支气管上皮细胞）成瘤细胞株中翻译起始因子eIF3 p36基因序列的变化情况，探讨镉、镍重金属的致癌分子机制。方法取正常对照16HBE细胞、氯化镉（CAC12）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化的16HBE细胞，用有限稀释法分别建立单细胞克隆株，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）获得目的基因翻译起始因子eIF3 p36的eDNA，将目的基因产物连接到T载体中，转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将三组DNA测序所得到的基因序列进行对比分析。结果镉、镍转化组各细胞株（各10株）翻译起始因子的eIF3 p36 cDNA测序结果与正常对照细胞（10株）比较未发现基因的突变位点；所有镉、镍转化细胞和正常对照细胞株eIF3 p36 cDNA序列与Genbank数据库进行同源性分析，相似性比值均为100％。结论实验中镉、镍恶性转化16HBE细胞中翻译起始因子eIF3 p36上调未见基因序列改变，提示在镉、镍致癌中可能涉及到表遗传机制。     

hOGG1基因在氯化镉恶性转化16HBE细胞系过程中的表达

目的探讨OGG1基因在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中mRNA的表达情况。方法用半定量反转录-聚合酶链反应(PT-PCR)技术检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系不同阶段(第5、15、32代细胞及成瘤细胞)hOGG1基因mRNA的表达情况。结果与16HBE细胞比较,hOGG1基因mRNA在第32代细胞及成瘤细胞的表达明显低下(P<0.01)。结论氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中hOGG1基因表达逐渐下降,hOGG1基因水平的改变可能是氯化镉的致癌机制之一。     

氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA损伤的研究

目的 探讨氯化镉恶性转化人支气管上皮(16HBE)细胞中DNA断裂损伤情况,进一步揭示氯化镉的致癌机制.方法 采用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)检测氯化镉恶性转化人支气管上皮细胞中非转化16HBE细胞、氯化镉恶性转化第15代、第35代细胞及成瘤细胞的DNA链断裂情况.结果 与非转化16HBE对照细胞比较,氯化镉恶性转化16HBE第15代、第35代细胞和氯化镉诱发16HBE恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的DNA损伤率分别达22.00%、46.75.00%和49.00%,明显高于非转化16HBE细胞的4.75%损伤率(P＜0.001),三种细胞彗星尾长也显著大于非转化16HBE细胞(P＜0.001).结论 细胞DNA损伤可能是镉化物分子致癌的重要机制.     

氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化不同阶段P16基因甲基化研究

目的对氯化镉（CdCl2）诱发16HBE细胞系恶性转化不同阶段P16基因启动子区甲基化状况进行研究，探讨镉的表遗传致癌机制。方法从各组CdCl2恶性转化不同阶段及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞中提取全基因组DNA，采取甲基化特异性PCR法（Methylation—specific PCR，MSP）检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状况，与非转化的16HBE对照细胞进行比较，并用去甲基化因子5-Azac（5-Aza-2＇deoxycytidine）处理有异常甲基化的细胞。结果CdCl2恶性转化及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞P16抑癌基因启动子区CpG岛存在异常高甲基化现象，且随着细胞恶性程度的增加，甲基化现象有明显升高的趋势，同时发现有异常高甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化现象消失。结论P16基因启动子区的高甲基化导致抑癌基因表达关闭，无法正常发挥细胞增殖周期对细胞分裂和生长的负调控，造成细胞周期失控而导致无限制地细胞增殖，这可能是氯化镉诱导16HBE细胞恶性转化及接种裸鼠成瘤的一种表遗传致癌作用。研究结果可部分解释镉化合物的细胞转化作用及其可能的表遗传致癌机制，以及进一步对甲基化的表型逆转和药物治疗研究提供了重要依据。     

Malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor in bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride

Objective To analyze the relationship between malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor 3 （eIF3 p36） in human bronchial epithelial （16HBE） cells induced by cadmium chloride （CdCl2）. Methods 16HBE cells were treated several times with different concentrations of CdCl2. Tumorigenic potential of transformed cells was identified by assays for anchorage-independent growth in soft agar and for tumorigenicity in nude mice after the 35th passage. Total RNA was isolated from 16HBE cells induced by CdC12, including non-transformed, Cd-transformed, and Cd-tumorigenic cell lines. Special primers for eIF3 p36 were designed and the expression of eIF3 mRNA in different cell lines was detected with fluorescent quantitative-polymerase chain reaction technique （FQ-PCR）. Results The 35th passage of 16HBE cells transformed by CdCl2 exhibited overlapping growth. Compared with the non-transformed cells, colonies of transformed cell lines in soft agar showed statistically significant increases and dose-dependent effects （P〈0.01）. All Cd-induced transformed cell lines formed rumors in nude mice within 2 weeks of inoculation, but none of the mice injected with non-transformed cells showed tumors even after 3 weeks. All tumors were pathologically identified as poorly differentiated squamous cell carcinoma. The eIF3 p36 genes in different stages of 16HBE cells transformed by CdCl2 were elevated as compared with the non-transformed control （P〈0.01）, and the eIF3 expression increased with the degree of cell malignancy. Conclusion CdCl2 is capable of inducing morphological transformation in 16HBE cells and transformed cells are potentially tumorigenic. Over-expression of eIF3 p36 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl2 and may be one of the molecular mechanisms potentially responsible for carcinogenesis due to Cd.     

PTEN、eIF4E及CyclinD1在胃癌中的联合表达及临床意义

目的探讨PTEN、eIF4E和CyclinD1在胃癌组织中的联合表达及其与肿瘤临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测56例胃癌组织和10例正常胃黏膜组织中PTEN、eIF4E和CyclinD1的表达。结果①PTEN在胃癌组织中蛋白表达阳性率为51．8％（29／56）,明显低于它在正常胃黏膜组织中的阳性表达率100．O％（10／10,P=0．012）;eIF4E和CyclinD1在胃癌组织中蛋白表达阳性率分别为76．8％（43／56）和51．8％（29／56）,明显高于它们在正常胃黏膜组织中的阳性表达率0％（0／10,P=0．000）和0％（0／10,P=0．007）;②P阳Ⅳ与胃癌组织分化程度呈正相关（P=0．029）,与胃癌浸润深度（P=0．033）、淋巴结转移呈负相关（P=0．003）;elF4E与胃癌组织分化程度呈负相关（P=0．010）,与胃癌浸润深度、淋巴结转移无相关关系;CyclinD1与胃癌的组织分化程度（P：0．004）、浸润深度（P=0．032）、淋巴结转移相关（P=0．013）;③胃癌中PTEN的阳性表达率与elF4E和CyclinD1均呈负相关（P=0．006,P=0．007）,eIF4E与CyclinD1的阳性表达率呈正相关（P=0．041）。结论PTEN、elF4E和CyclinD1在胃癌的发生、发展中起着不同的作用;联合检测PTEN、eIF4E和CyclinD1,可能有助于对胃癌恶性程度的判定及侵袭转移能力的评估,进而为胃癌的预后分析和进一步治疗提供依据。     

应用基因芯片技术筛查肺癌变相关基因的研究

目的 使用基因芯片技术研究肺鳞癌及化学致癌物诱导入气管上皮细胞恶性转化的癌变相关基因。方法 应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片分别检测6例肺鳞癌和6例正常肺组织的基因表达谱;并用上述芯片研究苯并(a)芘代谢产物BPDE[anti-Benzo(a)pyrene diolepoxide,BPDE]和结晶型硫化镍所诱导的人支气管上皮细胞恶性转化与正常的人支气管上皮细胞系(16HBE)在基因表达谱上的差异;将3类标本共同的差异表达基因确定为肺癌变的相关基因。结果 在肺鳞癌／正常肺组织之间、BPDE诱导的恶性转化细胞／正常16HBE细胞之间及硫化镍诱导的恶性转化细胞/正常16HBE细胞之间发现差异表达基因分别为171条、143条和151条。通过比较,发现89条与肺癌变相关的共同基因,其中表达显著增加的基因39条,它们是：癌基因6条;细胞周期相关基因4条;细胞增殖基因6条;肿瘤转移基因8条;神经内分泌基因3条;耐药基因1条;凋亡抑制基因1条;氧化基因1条;其他基因9条。表达显著下降的基因50条,它们是：抑癌基因7条;DNA修复基因11条;抗氧化基因1条;GST基因家族3条;细胞骨架基因3条;凋亡诱导基因2条;信号传导基因5条;细胞因子及其受体基因5条;细胞代谢基因7条,细胞外基质基因1条;其他基因5条。结论 cDNA基因芯片技术能有效地研究基因的表达谱,筛查出肺癌变相关基因。     

p16、nm23H1在淋巴瘤中的表达及临床意义

目的：探讨p16、nm23H1在淋巴瘸组织的表达及其与淋巴瘸临床病理特征、疗效、生存率的关系，从而为临床治疗和判断预后提供新的依据。方法：采用免疫组化S—P法。结果：1.霍奇金淋巴瘤（HL）及非霍奇金淋巴瘸（NHL）p16、nm23H1表达差异无显著性。2．随淋巴瘸恶性程度的升高，p16表达减弱，nm23H1表达增强（P〈0．01）。3.P16低表达组完全缓解（CR）率低于p16高表达组，nm23H1低表达组CR率高于高表达组，差异均有显著性（P〈0．05）。4．p16高表达组与p16低表达组生存率差异无显著性（P〉0．05），nm23H1低表达组生存率高于nm23H1高表达组（P〈0．01）。结论：p16、nm23H1表达水平不仅可反映淋巴瘤的恶性程度，而且可作为淋巴瘤的预后指标。     

p16蛋白在成釉细胞瘤中的表达

目的：研究成釉细胞瘤（ameloblastoma,AB)星网状层细胞增殖与分化的特点，探讨其生物学意义。方法：应用p16蛋白单克隆抗体免疫组化S－P法检测40例AB，其中原发17例，复发16例，恶变7例，此外用口腔粘膜鳞癌4例，淋巴结转移癌2例，基底细胞癌7例作对照观察。结果：40例AB的p16蛋白的缺失率为52．5％，其中，原发AB29．4％，复发AB62．5％，恶变AB85．7％，3组间P＜0．05。p16蛋白在多已发生角化的上皮样细胞当中有弱表达，但在星网支中原始胚样细胞多表达为阴性。结论：AB的发生与p16蛋白的缺失有关。随着复发与恶变的变化，p16蛋白缺失率增加（P＜0．05）。具有显著性意义。p16蛋白的阳性表达与细胞的分化状态有关。     

葡萄胎组织MMPs与TIMPs表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制物（TIMPs）在葡萄胎组织中的表达水平及其临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应方法测定35例葡萄胎（6例发生恶变，列为葡萄胎恶变组，29例为葡萄胎未恶变组）和18例正常绒毛组织（正常绒毛组）中MMP-7、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达水平。结果葡萄胎恶变组MMP-9／TIMP-1 mRNA比值高于正常绒毛组和葡萄胎未恶变组（F=3．62；q=3．82、3．57；P〈0．05）；MMP7、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA在各组中的表达差异无显著性（P〉0．05）。经Pearson相关性分析显示，在所有组织中MMP-9与MMP-7表达呈正相关（r=0．985，P〈0．01）。结论葡萄胎组织中MMP-9／TIMP-1比值对预测葡萄胎恶变有一定的作用，可为临床预防性化疗提供依据。     

Alterations of FHIT gene and P16 gene in nickel transformed human bronchial epithelial cells

INTRODUCTION Nickel is a widely distributed occupational and environmental pollutant. Epidemiological studies demonstrated that the incidence of respiratory tract cancer is correlated with worksite exposure to nickel. Nickel is also a potent carcinogen in laboratory animals. The International Agency for Research on Cancer (IARC) has classified nickel compounds as confirmed human carcinogens[1]. However, the mechanism of nickel carcinogenesis remains unknown. Insoluble nickel compounds…     

Alterative Expression and Sequence of Human Elongation Factor-15 during Malignant Transformation of Human Bronchial Epithelial Cells Induced by Cadmium Chloride

Objective To study the alternative expression and sequence of human elongation factor-1δ(human EF-1δ p31) during malignant transformation of human bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride (CdCI2) and its possible mechanism. Methods Total RNA was isolated at different stages of transformed human bronchial epithelial cells (16HBE) induced by CdCI<.2> at a concentration of 5.0 μM. Special primers and probe for human EF-1δ p31 were designed and expression of human EF-1δ mRNA from different cell lines was detected with fluorescent quantitative PCR technique. EF-1δ cDNA from different cell lines was purified and cloned into pMD 18-T vector followed by confirming and sequencing analysis. Results The expressions of human EF-1δ p31 at different stages of 16HBE cells transformed by CdCl<.2> was elevated (P<0.01 or P<0.05). Compared with their corresponding non-transformed cells, the overexpression level of EF-18 p31 was averagely increased 2.9 folds in Cd-pretransformed cells, 4.3 folds in Cd-transformed cells and 7.2 folds in Cd-tumorigenic cells. No change was found in the sequence of overexpressed EF-1δ p31 at different stages of 16HBE cells transformed by CdCl<.2>. Conclusion Overexpression of human EF-1δ p31 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl<.2>, but is not correlated with DNA mutations.     

白细胞介素-18促肾小管上皮细胞转分化的机制研究

目的探讨白细胞介素-18（IL-18）诱导体外培养的人近端肾小管上皮细胞转分化的细胞内信号的转导机制。方法应用细胞培养技术培养HK-2细胞。予不同浓度的p38MAPK通路特异性阻断剂SB203580预孵育细胞30min后,再加入IL-18共同培养。应用RT—PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,ELISA方法测定细胞胞浆中α—SMA的表达水平。结果SB203580可呈剂量依赖性地抑制IL—18诱导的HK-2细胞α-SMA基因和蛋白的表达。结论阻断p38MAPK信号通路可明显抑制IL—18诱导的HK-2细胞转分化作用：p38MAPK通路可能是调控IL-18诱导的HK-2细胞转分化的主要信号通路之一。     

血管内皮生长因子在六价铬诱导的肺支气管上皮细胞Beas-2B恶性转化中的作用

目的: 探究在六价铬\[Cr(Ⅵ)\]诱导的人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells 2B,Beas 2B）恶性转化过程中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在迁移、侵袭及血管生成等方面的生物学作用及其可能机制。方法: 通过对VEGF高表达的恶转细胞Cr(Ⅵ) Beas 2B转染重组VEGF质粒和siRNA,分别上调和下调VEGF的表达,利用蛋白免疫印迹检测VEGF表达及迁移侵袭相关蛋白表达,划痕实验、Transwell实验、免疫荧光实验检测细胞迁移、侵袭等运动能力的改变,以及小管生成实验检测细胞血管生成能力的变化。结果： 重组质粒过表达VEGF上调了恶转细胞中VEGF、基质金属蛋白酶 9、磷酸化黏着斑激酶和磷酸化Src蛋白的表达,下调了钙黏蛋白的表达;重组质粒过表达VEGF增强迁移、侵袭及血管生成能力;siRNA干扰处理结果相反。结论： VEGF通过影响迁移、侵袭相关蛋白的表达从而调控细胞迁移、侵袭以及血管生成,参与六价铬致癌过程。     

脂多糖诱导的人气道上皮细胞Caspase-1的表达研究

目的探讨脂多糖（LPS）诱导人气道上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）的表达情况。方法体外培养人气道上皮细胞,将其随机分为阴性对照组、LPS组及Caspase-1特异性抑制剂（Ac-YVAD-cmk）＋LPS组（简称cmk＋LPS组）。采用四氮唑盐（MTr）法测定各组细胞的增殖能力;实时荧光定量RT—PCR检测各组细胞Caspase-1mRNA的表达水平;Western—blot测定各组细胞Caspase-1蛋白的表达;ELISA法检测各组细胞上清液白介素1B（IL-1B）水平。结果3组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）;LPS组Caspase-1mRNA的表达水平较cmk＋LPS组和对照组增高,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;LPS组Caspase．1蛋白的表达明显高于对照组和cmk＋LPS组,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;LPS组IL．1B水平高于对照组和cmk＋LPS组,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NLRP3炎症复合体诱导的Caspase．1活化参与人气道上皮细胞LPS的致敏过程,并促进下游IL-1B的生成。