神经移植的种子细胞：大鼠骨髓基质细胞部分生物学特性

目的：分离培养SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cebls，BMSCs)，观察BMSCs部分生物学特性。方法：实验于2004—03／08在珠江医院广东省神经医学研究所实验室进行。采用密度梯度离心法分离BMSCs，MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞生长周期、鉴定细胞表面标志，免疫荧光染色观察细胞的神经分化功能及端粒酶反转录酶(TERP)表达。PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果：①采用密度梯度离心法可以得到高纯度的BMSCs，表达CD29，CD44等表面标志，而不表达CD3l，CD34，CD45。②BMSCs主要由Ⅰ，Ⅱ型两种形态的细胞组成，其中Ⅱ型细胞表达端粒酶活性并可以诱导分化为Nestin阳性细胞。③骨髓基质细胞原代培养时增殖能力较低。结论：BMSCs主要有两种形态和功能不完全相同的细胞类型组成，其中Ⅱ型细胞具有端粒酶活性，并在一定的诱导条件下可以分化为Nestin阳性细胞，可以考虑作为神经移植的种子细胞来源。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景:动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞.目的:观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达.方法:采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定.取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化.结果与结论:采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化.     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

兔骨髓基质细胞体外培养、诱导及分化成神经干细胞的实验研究

目的研究新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况. 方法梯度密度离心法分离新西兰大白兔骨髓基质细胞( BMSCs),于体外用神经干细胞培养基和多种细胞因子进行培养、诱导、分化,细胞免疫化学方法进行鉴定. 结果新西兰大白兔骨髓基质细胞能在体外培养中增殖、分化,具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白 (Nestin),这些细胞最终能分化出类神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有神经核蛋白抗体( NeuN)的表达. 结论新西兰大白兔骨髓基质细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的条件下,可以分化成能表达神经系细胞特异性抗原的细胞.骨髓基质细胞来源方便、取材较容易,体外培养和扩增的技术条件简便,具有向神经系细胞分化的潜能,可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞.     

兔骨髓基质细胞体外培养、诱导及分化成神经干细胞的实验研究

目的：研究新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况。方法：梯度密度离心法分离新西兰大白兔骨髓基质细胞(BMSCs)，于体外用神经干细胞培养基和多种细胞因子进行培养、诱导、分化，细胞免疫化学方法进行鉴定。结果：新西兰大白兔骨髓基质细胞能在体外培养中增殖、分化，具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)，这些细胞最终能分化出类神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经核蛋白抗体(NeuN)的表达。结论：新西兰大白兔骨髓基质细胞是具多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖、自我更新能力。在适宜的条件下，可以分化成能表达神经系细胞特异性抗原的细胞。骨髓基质细胞来源方便、取材较容易，体外培养和扩增的技术条件简便，具有向神经系细胞分化的潜能，可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞     

音猬因子诱导恒河猴间充质干细胞向神经样细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞,是神经系统疾病细胞治疗的有效手段,但目前的时效尚不完善.目的:应用神经发育音猬因子诱导恒河猴骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化.方法:应用经典的维甲酸方案与音猬因子方案两种方法诱导恒河猴骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,采用密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察生长情况,MTT法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型,免疫组织化学鉴定分化细胞标志,透射电镜和扫描电镜观察分化细胞超微结构.结果与结论:体外分离培养的恒河猴骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪表型鉴定,具有较高均一性.通过音猬因子诱导方案诱导处理7 d后,分化细胞多数表现为NSE、NF-M、Tau和Nestin染色阳性,经图像统计分析发现经音猬因子诱导方案神经干细胞标志物Nestin阳性率显著高于维甲酸诱导方案(P＜0.01),另一方面经维甲酸诱导方案诱导的细胞表现GFAP阳性率高于音猬因子诱导方案,差异具有显著性意义(P＜0.05).提示音猬因子诱导方案是一种诱导恒河猴骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的有效途径.     

密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养、鉴定和扩增的方法,同时观察BMSCs的生长特性,为组织工程中种子细胞的选择提供实验基础。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合分离纯化BMSCs并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD44的表达,进行表型鉴定。结果成功地完成了兔BMSCs体外分离培养及扩增。生长特性观察发现,第1～3代细胞增殖能力强,生长旺盛,随着传代次数的增加传代细胞增殖能力逐渐下降。分离培养的BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD34。结论体外应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合,可获得高纯度的BMSCs,培养的BMSCs呈纤维状、克隆样生长,第1～3代细胞活性较强,可作为组织工程的种子细胞用于进一步的实验研究。     

碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA体外定向培养骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：采用中药作为诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化是否会有效果呢？目的：验证碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入中药丹参酮ⅡA体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的效应。方法：采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞,取第3代细胞利用碱性成纤维细胞生长因子联合丹参酮ⅡA诱导其向神经元样细胞分化,全反式维甲酸无血清培养基诱导液及不进行诱导的细胞做为对照。结果与结论：①骨髓间充质干细胞能稳定表达间质细胞特异性的标记物CD44,表达阳性率为（91.00±1.58）%,但不表达CD34、CD45,流式细胞学检测其纯度高达95.5%。②诱导分化后经扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫组织化学检测细胞表达神经元特导性烯醇化酶,神经元特导性烯醇化酶阳性率为（75.60±2.31）%,Nestin呈一过性表达增加后随着诱导时间延长逐渐减低至阴性,不表达神经胶质纤维酸性蛋白。说明经碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA能高效地定向诱导神经元样细胞的分化。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导（含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L）,倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

体细胞重编程为干细胞的方法研究与进展

背景:克隆人类胚胎会引起伦理问题,这使科学家寻找替代的方法来逆向分化细胞为多能/全能干细胞,这个过程称为重编程。重编程的新方法是研究者关注的焦点。目的:探讨重编程技术的研究现状,并对体细胞重编程为干细胞的各种方法做一综述。方法:应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1983年1月至2006年12月关于重编程的文章,在标题和摘要中以"重编程,方法,体细胞,干细胞,分化"或"reprogramming,method,somatic cell,stem cell,differentiation"为检索词进行检索。选择文章内容与重编程有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。最终选择17篇文献进行综述。结果与结论:一个多能干细胞重编程状态是细胞结构逐步重构,染色质表观遗传改变,转录表达和转录后调控的结果。靶细胞的重塑要求重编程有一个稳定的状态,最终可以被重新定向到特定的分化程序。有充分的证据表明,细胞鉴定可以被体外操作影响,重编程细胞的命运需要进一步体内检测。     

体细胞重编程为干细胞的方法研究与进展

背景：克隆人类胚胎会引起伦理问题,这使科学家寻找替代的方法来逆向分化细胞为多能/全能干细胞,这个过程称为重编程。重编程的新方法是研究者关注的焦点。目的：探讨重编程技术的研究现状,并对体细胞重编程为干细胞的各种方法做一综述。方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1983年1月至2006年12月关于重编程的文章,在标题和摘要中以＂重编程,方法,体细胞,干细胞,分化＂或＂reprogramming,method,somatic cell,stem cell,differentiation＂为检索词进行检索。选择文章内容与重编程有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。最终选择17篇文献进行综述。结果与结论：一个多能干细胞重编程状态是细胞结构逐步重构,染色质表观遗传改变,转录表达和转录后调控的结果。靶细胞的重塑要求重编程有一个稳定的状态,最终可以被重新定向到特定的分化程序。有充分的证据表明,细胞鉴定可以被体外操作影响,重编程细胞的命运需要进一步体内检测。     

γδ+ T cells in Wilson's diseaseT cells in Wilson's disease

Little is currently known about the role of γδ^{+ +} T cells in disease pathogenesis. We have demonstrated elevated levels of γδ⁺ T cells in the peripheral blood and cerebrospinal fluid of patients with Wilson's disease compared with other neurological diseases. The percentage of of γδ⁺ T cells was between 20% and 50% in all patient groups: of γδ⁺ T cells in blood correlated with copper concentrations. The antigen reactivity of γδ^{+ +} T cells and how the antigens relate to the of γδ⁺ T cells found in WD remains unknown. It remains unclear whether there is a direct reason for the elevated of γδ⁺ T cells population found in WD. Immunohistochemistry of frozen autopsy material from brain and liver of WD patients could allow exact localization of γδ⁺ T cells and heat shock proteins in future studies.     

Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus

The present study was performed to identify cells responsible for the elimination of T cells reactive with minor lymphocyte-stimulating (Mls) antigens during T cell development. Experiments were carried out in a fetal thymus organ culture (FTOC) system. To examine the tolerance-inducing activity, various populations of cells from adult CBA/J (Mls-1a) mice were injected into deoxyguanosine (dGuo)-treated FTOC of C3H/He (Mls-1b) mice with a microinjector, and 2 d later, the thymus lobes were injected with fetal thymus cells from C3H/He mice as T cell precursors. After 14 d of cultivation, cells were harvested and assayed for the expression of the T cell receptor V beta 6 element. The absence or marked reduction of T cells expressing V beta 6 at high levels (V beta 6high) was regarded as indicating the deletion of Mls-1a-reactive T cells. T cell-depleted populations of thymic as well as splenic cells from CBA/J mice were able to induce clonal deletion. Further characterization of the effector cells was carried out by fractionating the spleen cells before injecting them into dGuo-FTOC. None of the dish-adherent population, dish-nonadherent population, or purified B cells alone were able to induce clonal deletion, whereas the addition of purified B cells to adherent cells restored tolerance inducibility. It was further shown that a combination of CBA/J B cells and C3H/He dendritic cells was effective in eliminating Mls-reactive clones. These results indicate that for the deletion of clones reactive with Mls antigens during T cell development in the thymus, both DC and B cells are required.     

Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung

Gas exchange in the lung occurs within alveoli, air-filled sacs composed of type 2 and type 1 epithelial cells (AEC2s and AEC1s), capillaries, and various resident mesenchymal cells. Here, we use a combination of in vivo clonal lineage analysis, different injury/repair systems, and in vitro culture of purified cell populations to obtain new information about the contribution of AEC2s to alveolar maintenance and repair. Genetic lineage-tracing experiments showed that surfactant protein C–positive (SFTPC-positive) AEC2s self renew and differentiate over about a year, consistent with the population containing long-term alveolar stem cells. Moreover, if many AEC2s were specifically ablated, high-resolution imaging of intact lungs showed that individual survivors undergo rapid clonal expansion and daughter cell dispersal. Individual lineage-labeled AEC2s placed into 3D culture gave rise to self-renewing “alveolospheres,” which contained both AEC2s and cells expressing multiple AEC1 markers, including HOPX, a new marker for AEC1s. Growth and differentiation of the alveolospheres occurred most readily when cocultured with primary PDGFRα⁺ lung stromal cells. This population included lipofibroblasts that normally reside close to AEC2s and may therefore contribute to a stem cell niche in the murine lung. Results suggest that a similar dynamic exists between AEC2s and mesenchymal cells in the human lung.     

Generation of self-macrophage-toxic non-T cells in the MHC-homozygous F1 spleen cells co-cultured with parental cells: possible involvements of host cells in impaired immunity in GVH disease

Simplified-in vitro system was developed to examine the contribution of host's cells in graft-versus-host (GVH)-disease-associated immunodeficiencies. In analogy with major histocompatibility complex (MHC)-matched GVH-reaction, (BALB/c x DBA/2)F1 (H-2d) hybrid spleen cells were co-cultured with irradiated BALB/c (H-2d) spleen cells, so that cellular activities to be generated are ascribable to F1 cells. In vitro development of anti-allo-specific cytotoxic T cells of the F1 origin was dramatically suppressed by coexistence of the irradiated parental cells and by the addition of F1 cells precultured once with the parental cells, suggesting the generation of suppressor cells in the F1 (host) cells activated by the parental cells. Thus generated suppressor cells are Thy.1-, weakly or nonadherent and radiosensitive. Interestingly, in the same reactions there also developed Thy.1- cytotoxic cells for autologous macrophage targets. An involvement in immunodeficiencies in GVH disease of the host-derived cytotoxic and/or immunosuppressive, non-T cells was discussed.     

人脐血细胞分化为神经细胞的体内实验研究

目的：人脐血富含干细胞和前体细胞，本文检索了人脐血治疗中枢神经系统疾病的体内实验研究状况、脐血细胞穿过血脑屏障的机制，并对其临床应用前景进行展望。资料来源：应用计算机检索PUBMED 1997-01／2005—10期间的相关文章，检索词为“Human umbilical cord blood cells，nerve cell”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索万方数据库2000-01／2005—10期间的相关文章，检索词为”脐血细胞，神经细胞”，并限定文章语言种类为中文。资料选择：对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与人脐血细胞的研究相关。排除标准：重复研究或Meta分析类文章。资料提炼：共收集到230篇相关文献，52篇文献符合纳入标准，排除的178篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的52篇文献中，36篇涉及人脐血治疗中枢神经系统疾病的体内实验研究状况，11篇涉及脐血细胞穿过血脑屏障的机制，5篇涉及人脐血细胞存在的问题与展望。资料综合：脐血富含干细胞和前体细胞，静脉注射人脐血细胞可进入脑内分化为神经干细胞、神经元和星形胶质细胞，提高脑和外周血神经营养因子水平，促进神经功能恢复。脑损伤后，病变组织表达趋化蛋白和黏附分子并释放多种化学物质及一系列生物活性因子，促使脐血中的骨髓间充质细胞、单个核细胞和造血细胞穿过损伤的血脑屏障进入脑内，向病灶迁移通过促进病灶周围的血管再生从而促进神经再生。脐血静脉移植为治疗神经退行性疾病提供了广阔的前景，脐血来源的干细胞可能将成为组织工程中的种子细胞，将对神经系统的细胞治疗和基因治疗起到极大地推动作用。结论：静脉注射人脐血细胞可进入脑内并分化为神经细胞，对神经功能缺损有改善作用，为脐血移植治疗神经系统疾病提供了新思路。