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1.
背景:已知端粒酶活性变化与组织工程应用的安全性密切相关,而目前端粒酶在骨髓间充质干细胞诱导分化过程中的变化及机制研究尚少。
目的: 观察体外人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化。
设计、时间及地点:细胞学开放性实验,于2006-12/2007-11在吉林大学第三临床医院实验中心及基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成。
材料:无菌条件下采集非血液系统疾病的志愿者髂骨骨髓,体外分离培养人骨髓间充质干细胞。
方法:取第3代培养的人骨髓间充质干细胞,应用二甲基亚砜/丁羟茴香醚(DMSO/BHA)联合诱导法诱导其向神经元样细胞分化。
主要观察指标:绘制体外培养的人骨髓间充质干细胞的生长曲线。免疫荧光及细胞化学染色法分别检测诱导后细胞的巢蛋白和尼氏体的表达,TRAP-ELISA方法检测人骨髓间充质干细胞诱导前后端粒酶活性的变化。
结果: 体外培养的人骨髓间充质干细胞在第3~8代生长较快,第10代以后细胞的生长能力明显减弱。经DMSO/BHA诱导分化后的细胞能够表达具有神经元特征的巢蛋白及尼氏体结构。此外,TRAP-ELISA结果显示诱导2 h细胞端粒酶活性变化不明显,当诱导6 h以后细胞端粒酶活性明显降低,诱导至24 h时,细胞端粒酶活性已近阴性(P < 0.05)。
结论:人骨髓间充质干细胞在体外成功诱导分化为神经元样细胞的过程中端粒酶活性逐渐降低直至消失。 相似文献
2.
目的 体外探讨全反式维甲酸(ATRA)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用。方法 从大鼠股髓分离出MSCs,采用贴壁法体外扩增、传代,取5代后细胞采用EGF共培养,二巯基乙醇(2-ME)预诱导,再以ATRA为诱导剂诱导,然后免疫细胞化学检测巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果 MSCs诱导后具有神经元样细胞的形态,免疫细胞化学显示nestin、NSE、AchE有阳性表达,而GFAP、TH表达为阴性。结论 ATRA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,且可表达AchE。 相似文献
3.
背景:文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见。
目的:建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。
方法:密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。
结果与结论:分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%。结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。 相似文献
4.
人骨髓间质干细胞的分离培养和诱导分化为神经元样细胞的研究 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:探索成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化为神经元样细胞的体外条件。方法:采用Ficoll淋巴细胞分离液(1.077g·mL-1)密度梯度离心法从人的骨髓中分离出MSCs进行体外扩增。收集第2代细胞流式细胞仪检测MSCs表面标志。逐渐加入表皮生长因子(EGF)、β-巯基乙醇(BME)和全反式维甲酸(ATRA)诱导MSCs向神经元细胞分化,通过免疫细胞化学法鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(nsetin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果:流式细胞仪检测结果显示培养后的MSCs强表达CD29;较强表达CD44、CD166和CD105;不表达CD45、CD34和HLA-DR。诱导剂诱导后,MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫细胞化学显示78%的细胞NSE表达阳性;大约51%细胞nsetin表达阳性;所有细胞GFAP均阴性表达。结论:成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,且具有较高的阳性分化率。 相似文献
5.
成人骨髓间充质干细胞的体外培养和定向神经分化 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 探讨成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和定向神经诱导分化的条件.方法 从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有脑源性生长因子(BDNF)联合维A酸(RA)的培养液对传至3~5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定.结果 诱导1h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,6h后大部分细胞具有典型神经元形态.表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞占细胞总数的(46.45±2.54)%.结论 MSCs可通过体外培养并纯化,应用BDNF联合RA可以在体外诱导MSCs成为神经元样细胞. 相似文献
6.
背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。
目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。
方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。
结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。 相似文献
7.
背景:目前大量研究证明传统中药可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。
目的:观察中药血府逐瘀注射液对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找血府逐瘀注射液诱导分化的最佳浓度。
设计,时间及地点:细胞对照观察实验。实验于2009-07/2010-04在
广东医学院附属医院神经病学研究室及中心实验室完成。
材料: 4周龄SPF级SD雄大鼠,体质量约100g;血府逐瘀注射液的主要中药成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归。
方法:SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,3.00,5.00,10.00 g/L 4种剂量血府逐瘀注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较4种剂量血府逐瘀注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。
主要观察指标:骨髓MSCs生长情况和形态观察,骨髓MSCs表面标志物的表达情况及诱导分化后神经细胞特异性标志物的表达。
结果与结论:①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(96.18±1.65)% CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,3.00 g/L浓度组细胞的巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示血府逐瘀注射液可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,3.00 g/L为最适诱导浓度。 相似文献
8.
MSCs源性神经元细胞移植对脑梗死模型鼠学习记忆功能的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化为的神经元样细胞移植对大脑中动脉阻塞 (MCAO)模型鼠学习记忆能力的恢复作用。方法采用分离消化法对Fischer344大鼠的骨髓间充质干细胞进行体外培养、纯化鉴定后,将其诱导为神经元样细胞,通过局部立体定位注射于MCAO大鼠纹状体皮质,对照组注射L- DMEM培养液。骨髓间充质干细胞移植后第2周及第8周,行Morris水迷宫测试。结果水迷宫试验中,第2周及第8周移植组、对照组找到目标的时间(s)及路径(cm)结果经组间比较P<0.05,具有统计学意义。结论 MSCs源性神经元样细胞移植对MCAO模型鼠的学习记忆能力有一定的恢复作用。 相似文献
9.
背景:目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。
目的:探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。
方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。
结果与结论:骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示:全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。 相似文献
10.
目的:观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况。
方法:取肝素抗凝人骨髓血,Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,胰酶消化后传代扩增。取第4~6代骨髓间充质干细胞,当细胞达90%融合时,按2×103/孔接种于24孔板内,第2天分为两组,诱导组用含有50% C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基(含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基)诱导,每隔2 d换液1次;对照组单纯加入完全培养基进行培养。诱导后3 d,两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色,检测神经元特异性标志物的表达。
结果:诱导24 h后,诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观,对照组细胞形态无明显变化。诱导3 d后,诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组(P < 0.01);诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为(44.2±2.4)%,对照组为阴性;两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达。
结论:鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。 相似文献
11.
目的 探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞体外向多巴胺能样神经元分化的潜能,并优化诱导方案.方法 体外分离培养底蜕膜间充质干细胞,用表皮生长因子(EGF)+人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+ B27添加剂和人音猬因子(SHH)+成纤维细胞生长因子8(FGF8)+forskolin+脑源性神经营养因子(BDNF)分两个阶段对其进行诱导;免疫细胞化学先后检测干细胞标记nestin和CD133、成熟神经元标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质细胞标记胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶(TH)的表达;Western blot验证诱导后TH蛋白的表达;高效液相色谱-电化学检测诱导前后多巴胺的分泌.结果 经第一阶段诱导后,细胞形成漂浮生长的神经球,nestin和CD133均呈阳性表达;第二阶段诱导后,出现明显的神经元样形态,NSE、GFAP和TH均阳性表达,Western blot也显示TH蛋白的表达,多巴胺分泌量相比诱导前明显增加(P<0.001).结论 底蜕膜间充质干细胞体外可分化为多巴胺能样神经元,可能成为帕金森病干细胞移植治疗新的种子细胞来源. 相似文献
12.
碱性成纤维细胞生长因子等体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外定向诱导分化为神经元样细胞。方法 采用Percoll分离液离心分离hMSCs,体外扩增,分别采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和2-巯基乙醇(2-ME)等无血清DMEM诱导hMSCs分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSCs在体外扩增传至5代后,流式细胞仪显示99.5%,97.8%,98.8%hMSCs表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性。接种到12孔板,3d后加入bFGF和2-ME联合或2-ME单种诱导剂诱导后,hMSCs胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论 成人骨髓间干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。 相似文献
13.
背景:目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。
目的:探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。
方法:将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组:条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。
结果与结论:诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。 相似文献
14.
Comparative analysis of neuroectodermal differentiation capacity of human bone marrow stromal cells using various conversion protocols 总被引:5,自引:0,他引:5
Hermann A Liebau S Gastl R Fickert S Habisch HJ Fiedler J Schwarz J Brenner R Storch A 《Journal of neuroscience research》2006,83(8):1502-1514
Human adult bone marrow-derived mesodermal stromal cells (hMSCs) are able to differentiate into multiple mesodermal tissues, including bone and cartilage. There is evidence that these cells are able to break germ layer commitment and differentiate into cells expressing neuroectodermal properties. There is still debate about whether this results from cell fusion, aberrant marker gene expression or real neuroectodermal differentiation. Here we extend our work on neuroectodermal conversion of adult hMSCs in vitro by evaluating various epigenetic conversion protocols using quantitative RT-PCR and immunocytochemistry. Undifferentiated hMSCs expressed high levels of fibronectin as well as several neuroectodermal genes commonly used to characterize neural cell types, such as nestin, beta-tubulin III, and GFAP, suggesting that hMSCs retain the ability to differentiate into neuroectodermal cell types. Protocols using a direct differentiation of hMSCs into a neural phenotype failed to induce significant changes in morphology and/or expression of markers of early and mature glial/neuronal cells types. In contrast, a multistep protocol with conversion of hMSCs into a neural stem cell-like population and subsequent terminal differentiation in mature glia and neurons generated relevant morphological changes as well as significant increase of expression levels of marker genes for early and late neural cell types, such as nestin, neurogenin2, MBP, and MAP2ab, accompanied by a loss of their mesenchymal properties. Our data provide an impetus for differentiating hMSCs in vitro into mature neuroectodermal cells. Neuroectodermally converted hMSCs may therefore ultimately help in treating acute and chronic neurodegenerative diseases. Analysis of marker gene expression for characterization of neural cells derived from MSCs has to take into account that several early and late neuroectodermal genes are already expressed in undifferentiated MSCs. 相似文献
15.
Role of vascular endothelial growth factor in neuronal DNA damage and repair in rat brain following a transient cerebral ischemia 总被引:26,自引:0,他引:26
Yang ZJ Bao WL Qiu MH Zhang LM Lu SD Huang YL Sun FY 《Journal of neuroscience research》2002,70(2):140-149
The antisense knockdown technique and confocal laser scanning microscopic analysis were used to elucidate vascular endothelial growth factor (VEGF) induction and its effect on DNA damage and repair in rat brain following a transient middle cerebral artery occlusion. Immunohistochemical study and in situ hybridization showed that the expression of VEGF and its mRNA was enhanced in the ischemic core and penumbra of ischemic brain. Western blot analysis further illustrated that VEGF induction was time-dependently changed in these areas. Double-staining analysis indicated that VEGF-positive staining existed in the neuron, but not in the glia, and it colocalized with excision repair cross-complementing group 6 (ERCC6) mRNA, a DNA repair factor. VEGF antisense oligodeoxynucleotide infusion reduced VEGF induction and resulted in an enlargement of infarct volume of the brain caused by ischemia. Moreover, it also increased the number of DNA damaged cells and lessened the induction of ERCC6 mRNA in ischemic brains. These results suggest that the induction of endogenous VEGF in ischemic neurons plays a neuroprotective role probably associated with the expression of ERCC6 mRNA. 相似文献
16.
Expression and modulation of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitors of metalloproteinases in human embryonic CNS stem cells 总被引:2,自引:0,他引:2
Frölichsthal-Schoeller P Vescovi AL Krekoski CA Murphy G Edwards DR Forsyth P 《Neuroreport》1999,10(2):345-351
The expression and regulation of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MMPs (TIMPs) in neuroectodermal precursor cells is undocumented. We report the presence of MMP-2, but no MMP-9, and of all the four known TIMPs in neuroepithelial stem cells isolated from the human CNS. The expression of TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3 was unchanged following stem cells differentiation into neurons and glia. In contrast, while MMP-2 and TIMP-4 were localized to both stem and mature CNS cells, their levels of expression were substantially reduced in the latter. TIMP-4 showed a 23-fold reduction in media conditioned by differentiated cells compared with stem cell-conditioned media, reflecting a 6-fold decrease in mRNA expression. Interestingly, TIMP-4 also differed from the other TIMPs in that it was cell-associated in the stem cells, where this fraction remained unchanged upon differentiation. Hence, regulation of selective MMPs and TIMPs occurs during differentiation of human neural precursors suggesting that MMP-2 and TIMP-4 in particular may perform regulatory roles in the developing CNS. 相似文献
17.
Uric acid is an important, naturally occurring serum antioxidant. The present study investigates the use of uric acid for promoting proliferation and neuronal differentiation of mesenchymal stem cells derived from human placenta tissue. Human placenta-derived mesenchymal stem cells were pre-induced in the presence of either 0, 0.2, 0.4 or 0.8 mM uric acid in combination with 1 mM β-mercaptoethanol for 24 hours, followed by exposure to identical uric acid concentrations and 5 mM β-mercaptoethanol for 6 and 10 hours. Cells developed a neuronal-like morphology, with formation of interconnected process extensions, typical of neural cells. Immunocytochemistry and immunofluorescence staining showed neuron specific enolase positive cells were present in each group except the control group. A greater number of neuron specific enolase positive cells were observed in 0.8 mM uric acid in combination with 5 mM β-mercaptoethanol at 10 hours. After 24 hours of induction, Nissl bodies were detected in the cytoplasm of all differentiated cell groups except the control group and Nissl body numbers were greatest in human placenta-derived mesenchymal stem cells grown in the presence of 0.8 mM uric acid and 5 mM β-mercaptoethanol. These results suggest uric acid accelerates differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into neuronal-like cells in a time-and concentration-dependent manner. 相似文献