嗅成鞘细胞与神经干细胞共移植对阿尔茨海默病大鼠的治疗作用

目的探讨嗅成鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)移植治疗大鼠阿尔茨海默病(AD)的影响。方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1～40,建立AD大鼠模型。实验动物分为4组:NSCs移植组、NSCs与OECs移植组、AD模型组、正常对照组,每组30只。从SD胎鼠(孕16～18 d)取材,在体外分别培养和共培养OECs与NSCs,并将共培养的OECs与NSCs移植于AD大鼠大脑;观察各组大鼠行为学、移植细胞存活、迁移和分化以及宿主脑海马突触素表达的变化。结果①行为学测试:NSCs与OECs移植组潜伏期明显缩短、过平台次数明显增加,与NSCs移植组、AD模型组有显著性差异(P<0.05)。②根据标记跟踪,植入的NSCs与OECs大量存活,从注射部位分别向两侧海马区及其周围皮质迁移。③免疫荧光检测:植入NSCs能在AD脑内分化为神经元、神经胶质细胞以及少量胆碱能神经元,NSCs与OECs移植组分化为神经元的分化率13.97%,与NSCs移植组8.35%差异显著(P<0.05)。④海马突触素表达:NSCs与OECs移植组IA值最高,与NSCs移植组、AD模型组有显著性差异(P<0.05)。结论嗅成鞘细胞通过改善植入神经干细胞在AD脑内的存活、迁移和分化能力以及与宿主脑的联系,提高NSCs移植治疗大鼠AD的效果。     

移植入阿尔茨海默病大鼠海马内神经干细胞的存活、迁移和分化

目的 观察新生大鼠海马齿状回的神经干细胞(NSCs)移植到阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马内的存活、迁移和分化.方法 将HoechsT_33258标记的NSCs植入AD模型大鼠海马,移植2、4和6 w后,行Y迷宫检测大鼠的学习记忆能力,结合HoechsT_33258标记和荧光免疫组化技术,分析NSCs在AD大鼠海马中的存活、迁移和分化.结果 移植的NSCs在宿主脑内能够存活至少6 w,沿海马回向两侧迁移,NSCs移植2 w后,免疫荧光检测无明显神经丝蛋白-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、谷氨酸(Glu)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性反应,而移植后4、6 w,则可见免疫阳性反应细胞.Y迷宫测试结果显示移植NSCs 2、4、6 w后大鼠学习、记忆能力明显得到恢复,与AD模型组比较有统计学意义(P<0.05),与正常对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 自新生大鼠海马齿状回分离培养的NSCs在AD模型大鼠海马内能够存活、迁移并分化为胆碱能、谷氨酸能神经元及神经胶质细胞.     

机械分离与胰酶消化分离对长期培养的神经干细胞神经发生能力的影响

目的 探讨神经干细胞(NSCs)培养的分离传代技术及其在长期培养条件下的神经发生能力.方法取孕14d的Wistar胎鼠大脑皮层,消化分离后,以1×105/ml浓度进行NSCs原代培养.分别采用机械分离与胰酶消化法进行NSCs传代培养,台盼蓝活细胞计数测定分离后细胞存活率,计算细胞倍增时间和细胞增殖率.取第4、8、12、20、30代机械分离传代培养的NSCs球接种到24孔培养板中的盖玻片上,加入分化培养液,观察长期培养条件下NSCs的神经发生能力的变化.结果与胰酶消化法进行的NSCs球传代相比,机械分离的NSCs球为小细胞球和单细胞传代,传代后细胞存活率高,细胞倍增时间短,增殖能力强(P均<0.05).体外长期培养条件下,随着培养时间的延长,NSCs分化为神经元的比例逐渐降低,星形胶质细胞的比例逐渐增高;在4～12代NSCs分化为神经元的能力表现出下降的趋势,但仍较为稳定;12代后,神经元的分化比例迅速下降,星形胶质细胞的比例迅速上升.结论与胰酶消化法相比,逐步减小吸管口径的机械分离传代法,减少了传代对细胞的损伤,保证了大部分细胞间连接的完整性,显著增强了NSCs的增殖能力.体外长期扩增的NSCs,由于微环境和(或)自身基因的调控.随着传代的延续,其神经发生能力逐渐降低,分化为神经元的比例逐渐减少,分化为星形胶质细胞的比例逐渐增加.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的初步研究

目的探讨体外培养、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,诱导MSCs向神经元样细胞定向分化。方法取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSCs,进行培养扩增,观察其生物学特性;用IBMX诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离,并可在体外大量扩增,经IBMX诱导,MSCs可向神经元样细胞分化,出现胞体和突起,细胞免疫化学染色神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白呈阳性。结论MSCs易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,诱导剂作用下可分化出神经元样细胞。     

脐血单个核细胞体外向神经干细胞的诱导及Foxg1基因的表达

目的探讨人脐血单个核细胞（UBC-MNCs）体外向神经干细胞（NSCs）的诱导分化机制及NSCs中Foxg1基因表达的意义。方法从脐血中分离出UBC—MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasa1培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察NSCs形态学及增殖分化特点;免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP的表达情况,BrdU标记靶细胞;RT-PCR法检测分离后、培养3、6、9、12d细胞中Foxg1基因的表达。结果UBC—MNCs可定向诱导分化为神经元样细胞,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原。Foxg1 mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高（P〈0．05）,6d达高峰,之后逐渐下降（P〈0．05）。结论体外定向诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,Foxg1基因是NSCs增殖分化关键调控因子,脐血可成为NSCs的新来源。     

叶酸诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的浓度探索

目的 探讨叶酸对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的最佳浓度.方法 MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁离心获得,取第5代MSCs以1 mmol/L二巯基乙醇(BME)预诱导24 h后,用羟基茴香醚(BHA)、2%二甲基亚砜(DMSO)和3种不同浓度的叶酸诱导分化,采用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶原纤维酸性蛋白GFAP的表达,MTT(四唑盐比色)法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响.结果 不同剂量叶酸组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都较对照组高(P<0.01) ,但以40 mg/L中等浓度的叶酸神经细胞最多,且神经元比例高于其他组.结论 叶酸诱导BMSCs向神经元分化以40 mg/L浓度为最佳.     

改良型生物硅胶膜对大鼠神经干细胞增殖与分化的影响

目的观察改良型生物硅胶膜对神经干细胞（NSCs）增殖与分化的影响,为选择NSCs培养载体提供依据。方法选取孕16d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,建立胚胎NSCs的体外培养体系并随机分为观察组和对照组,其中观察组接种于改良型生物硅胶膜上、对照组接种于普通培养皿中。普通倒置显微镜及电镜下观察细胞生长发育形态学变化,免疫荧光染色技术对NSCs及诱导分化细胞进行鉴定,四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测细胞增殖情况。结果培养2d后,显微镜下两组均可见神经细胞球生成,贴壁良好,细胞球边缘有突起呈辐射状向外发出,神经球NSCs特异标志物神经巢蛋白均呈阳性;培养7d后,观察组和对照组贴壁分化的神经元烯醇化酶阳性细胞率分别为25．14％±1．98％、24．67％±2．05％,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率分别为59．48％±2．07％．60．87％±1．08％,组间比较,P均〉0．05;两组生长曲线亦无显著差异（P〉0．05）。结论改良型生物硅胶膜对NSCs的生长、增殖及诱导分化无明显影响,但能促进细胞之间突起的增长,可作为培养载体用于研究力学因素对NSCs增殖、诱导分化的影响。     

银杏叶提取物对活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察银杏叶提取物（EGB）对活性氧诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法用含100 g/L小牛血清的DMEM体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,用不同浓度的过氧化氢（H2O2）作为外源性活性氧刺激VSMC增殖,应用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）掺入和细胞周期时相测定等方法观察给予不同浓度的EGB预处理后,EGB对H2O2作用后VSMC的增殖的影响。结果H2O2对VSMC的增殖活性具有剂量依赖性促进作用,EGB可以抑制H2O2诱导的VSMC增殖,且具有剂量依赖性。结论EGB对于动脉粥样硬化形成及经皮腔内冠状动脉介入治疗后再狭窄的防治可能具有应用前景。     

大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定

探讨胚胎大鼠神经干细胞（NSCs）的分离培养和鉴定方法。采用无血清培养液，从胚胎大鼠脊髓分离和培养NSCs，应用^3H-TdR掺入技术和免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。结果表明，从E16胚胎大鼠脊髓分离培养的细胞具有NSCs特征，可在体外增殖存活，经1％胎牛血清诱导可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。认为从胚胎大鼠脊髓成功分离培养的NSCs可在体外稳定地培养和传代，是研究细胞移植和基因治疗的理想细胞来源。     

不同传代倍数BMSCs向神经元样细胞分化后移植对认知功能障碍大鼠学习记忆能力的影响

目的 观察不同传代倍数骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化后移植对认知功能障碍大鼠学习记忆能力的影响.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增Wistar大鼠BMSCs.选取第3、4、5代BMSCs用bFGF(20 ng/mL)进行诱导48 h.自然衰老Wistar大鼠通过Morris 水迷宫筛选后随机分为4组,每组10只.对照组大鼠双侧海马注入生理盐水;3、4、5代细胞组大鼠分别注入向神经元样细胞诱导后的3、4、5代BMSCs.大鼠的学习记忆能力在移植前和实验后4周通过Morris水迷宫试验测定.结果 成功分离培养Wistar大鼠BMSCs,经诱导后大部分分化为神经元样细胞.与移植前相比,对照组大鼠学习记忆成绩下降(P>0.05);3、4、5代细胞组大鼠学习记忆成绩均有提高(P<0.05).与对照组相比,3、4、5代细胞组大鼠学习记忆成绩均有提高(P<0.05).3、4、5代细胞组间两两比较,差异均有显著性(P<0.05).结论 3、4、5代大鼠BMSCs向神经元样细胞分化后移植均可提高认知功能障碍大鼠的学习记忆能力,且4代细胞移植效果优于3代和5代.     

shR-377联合细胞因子诱导人脂肪间充质干细胞向神经干细胞定向分化

目的探索sh R-377联合细胞因子诱导人脂肪间充质干细胞(HADMSCs)向神经干细胞(NSCs)定向分化。方法采用吸脂术获取健康青年人腹部大网膜脂肪组织,胶原酶消化法分离HADMSCs,行表型鉴定和细胞周期检测。sh R-377转染第三代HADMSCs,48 h后流式检测nestin表达率,72 h后行RT-q PCR和免疫细胞化学测定nestin和musashi,并对转化后细胞增殖培养分析。结果流式结果显示HADMSCs表面标志CD45及CD117表达呈阴性,CD29及CD44呈阳性,诱导24 h后nestin表达率为(64.6±3.2%);RT-q PCR结果表明诱导72 h后神经干样细胞球nestin、musashi表达阳性,免疫细胞化学染色可见nestin染色阳性。神经干样细胞球增殖培养7 d可见多个克隆球。神经干样细胞球进一步分化培养,可见到很明显的细长突触,双极或多极神经元样形态。结论 sh R-377联合细胞因子的诱导方法可以使HADMSCs定向分化为NSCs,诱导时间约48 h。转化时间和转化率比传统方法有较大提高,为体外大量获得NSCs提供了实验依据。     

盐酸法舒地尔对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的观察盐酸法舒地尔对体外培养神经干细胞（NSCs）分化的影响。方法体外分离培养NSCs,通过不同浓度的盐酸法舒地尔干预后,采用免疫细胞化学及流式细胞技术检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果分离培养的NSCs具有自我复制、增殖能力,可以表达Nestin;诱导分化后的细胞可以表达NSE和GFAP。免疫细胞化学染色提示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞显著高于对照组（P〈0．05）,但是不同浓度盐酸法舒地尔之间元统计学差异（P〉0．05）。流式细胞仪检测结果显示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞比例明显增加,与对照组相比有统计学差异（P〈0．05）。结论盐酸法舒地尔可以促进NSCs向神经细胞方向分化。     

β-BME与BDNF联合RA体外诱导成人MSCs分化为神经元样细胞对比观察

目的 寻找体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的良好方法.方法 分别采用β-巯基乙醇(BME)、脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸(RA)为诱导剂,体外诱导人MSCs分化为神经元样细胞.用免疫组化SP法对诱导后细胞进行鉴定.结果 两种方法诱导6 h后,MSCs均呈现神经元样细胞改变,伸出突起,类似树突和轴突.该细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)均呈阳性表达,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)均呈阴性表达.其中β BME诱导6 h后神经元样细胞分化率为68.32%±2.58%,BDNF+RA诱导6 h后神经元样细胞分化率仅为42.45%±3.26%,两组比较,P＜0.05.但β BME诱导后分化细胞存活时间较短,而BDNF+RA诱导后分化细胞存活时间较长.结论 两种诱导方法均可在体外定向诱导人MSCs转化为神经元样细胞,神经元分化率及存活时间不同.     

新生大鼠海马神经干细胞的分离、培养、分化和鉴定

目的:探讨从新生大鼠海马分离神经干细胞并进一步培养、诱导分化和鉴定的可行性。方法:分离出生1d大鼠海马,吸管吹打机械分离制成单细胞悬液,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化,应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞。结果:从新生大鼠海马分离的细胞呈巢蛋白免疫阳性并能在体外传代培养和连续形成克隆;血清诱导分化后的细胞可分别表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗原β-微管蛋白Ⅲ和神经胶质原纤维酸性蛋白。结论:分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,说明新生大鼠海马存在神经干细胞,并可用于进一步的实验研究。     

大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

目的探讨大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经样细胞的作用。方法分离得到的MSCs在体外扩增、传代。用碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后加入不同时间的臂丛神经损伤大鼠脊髓匀浆上清液诱导。免疫细胞化学染色检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。结果细胞诱导后具有神经元或胶质细胞样细胞的形态,相应细胞表面标志NSE或GFAP阳性,以损伤后7d脊髓匀浆上清液诱导组NSE阳性和GFAP阳性率最高(P<0.05)。结论臂丛根性撕脱伤大鼠脊髓匀浆上清液在体外能够有效地诱导骨髓MSCs分化为神经样细胞,伤后1w可以作为MSCs移植的最佳时间。     

多效生长因子在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的表达变化

目的探讨多效生长因子(PTN)在体外诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化中过程不同时间的表达变化,了解多效生长因子是否参与BMSCs向神经元样细胞分化的机制。方法以密度梯度离心加贴壁培养法分离成人BMSCs,进行原代和传代培养,以流式细胞仪鉴定纯度。对照组和实验组对传代第6代的BMSCs进行诱导分化,诱导后30min至3d,观察细胞形态并计数。将分化后细胞采用免疫细胞化学法测定神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。对诱导前和诱导后3h、6h、12h、24h、3d细胞以RT-PCR法测定PTN mRNA表达。结果 BMSCs在接种1d后黏附贴壁,呈椭圆形或圆形,3d~5d后呈梭状细胞成簇生长,7d~12d融合。传代至第5代~6代可见较为均一的成纤维细胞样形态。流式细胞仪检测结果显示:细胞表达CD44、CD105,不表达造血干细胞的特异标记CD45,证实其纯度。诱导后细胞胞体开始向细胞胞核收缩,出现双极或多极细胞。12h变形细胞增多,细长突起相互连接。24h后细胞变化不明显。诱导后细胞经免疫化学染色显示:多数表达NSE(64.79±0.06)%、MAP-2(60.05±0.09)%,而未检测到GFAP。实验组诱导后细胞不同时间点PTN mRNA的表达不同(P0.01)。诱导后12h~24hPTN mRNA表达最高。结论建立成人BMSCs培养增殖体系基础上诱导BMSCs向神经元样细胞分化,诱导过程细胞有外观形态变化,同时表达神经细胞特异性标志物NSE和MAP-2。诱导后BMSCs与形态改变相似,向神经元样细胞分化的不同时间点,有PTN mRNA表达变化,提示PTN可能参与BMSCs向神经元样细胞的分化。     

脑缺血对阿尔茨海默病大鼠海马内病理特征及炎性反应的影响

目的观察脑缺血后阿尔茨海默病(AD)大鼠海马内的病理特征、炎性细胞及细胞因子表达的变化,探讨脑缺血在AD病程进展中的作用及机制。方法经Morris水迷宫筛选SD大鼠30只.随机分为AD组、AD+脑缺血组、对照组,每组10只。大鼠海马注射凝聚态淀粉β样蛋白_(1-10)成功建立AD模型后.海马注射内皮素-1建立脑缺血条件,观察脑缺血后AD大鼠海马内淀粉β样蛋白(Aβ)的沉积及神经元丢失的变化,采用免疫组织化学、原位杂交和RT-PCR检测脑缺血后AD大鼠海马内星形胶质细胞的数量和白细胞介素1β(IL-1β)、TNF-α表达的变化。结果与对照组比较,AD组和AD+脑缺血组大鼠海马星形胶质细胞数量、IL-1β和TNF-α表达均显著增多(P<0.01)。结论脑缺血促进了AD大鼠海马内Aβ的沉积和神经元的丢失,提示脑缺血可促进AD的病程进展,星形胶质细胞、IL-1β和TNF-α参与了这一过程。     

肝再生大鼠血清诱导骨髓干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的观察肝大部切除大鼠再生血清和肝细胞生长因子(HGF)诱导骨髓干细胞向肝实质细胞分化的作用；探讨骨髓干细胞向肝细胞分化和增殖的体外培养条件和方法，为患者应用自身骨髓细胞修复损伤肝脏提供实验依据。方法制作肝大部切除大鼠肝再生动物模型，收集术后24h血清；分别应用鼠肝再生血清和HGF对大鼠骨髓细胞进行定向诱导分化培养；以免疫组化、RTPCR和western blot等方法对分化不同阶段细胞进行检测。将分化细胞经尾静脉输入同系大鼠，观察输注细胞在肝、脾内的生长情况。结果活体移植分化细胞能定向迁移至肝和脾；体外及体内分化细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达白蛋白，并在一定时期内表达甲胎蛋白。结论大鼠骨髓干细胞在肝大部切除再生血清或HGF的诱导下能横向分化为肝实质样细胞。     

Wnt信号通路分子在大鼠神经干细胞分化过程中的表达

目的：观察Wnt信号通路主要分子[β-连环蛋白（β-catenin）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）]在神经干细胞（NSCs）体系的表达及其在增殖和分化过程中的变化,探讨其在神经干细胞分化中可能的调控作用。方法采用原代培养方法,自14～16d大鼠胚胎大脑皮质获得含大量细胞团的NSCs体系。应用含10%胎牛血清培养液诱导NSCs分化。Western印迹检测NSCs在加入胎牛血清12,24,48和72h后,β-catenin与GSK-3β在分化过程中的动态变化。结果免疫细胞化学染色显示NSCs细胞团及散在的单个细胞多呈巢蛋白（nestin）阳性,显示NSCs分化过程中两者存在持续表达,β-catenin分子表达呈现逐渐减少趋势,而GSK-3β分子表达则呈现逐渐增加趋势。结论提示Wnt信号通路与NSCs的增殖和分化过程密切相关,呈现出由活跃到逐步抑制的过程,为研究Wnt信号通路参与NSCs增殖分化调控的机制提供了载体。     

氯离子通道阻断剂对大鼠离体海马神经元凋亡的影响

目的 通过观察氯离子(Cl-)通道阻断剂对一氧化氮(NO)供体3-吗啉斯德酮胺(SIN-1)诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的效应,探讨Cl-通道在缺血性脑损伤中的作用.方法 离体培养12 d的SD大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、SIN-1处理组、SIN-1处理后和Cl-通道阻断剂组,对各组神经元分别在相应的时间点进行Hoechst荧光染色观察凋亡细胞数和MTT实验定量检测神经元的存活率.结果 SIN-1能明显诱导神经元凋亡(P<0.05),SITS和DIDS呈剂量依赖性地抑制NO诱导的神经元损伤,提高神经元的存活率,与SIN-1组相比差异显著(P<0.05).结论 Cl-通道阻断剂对NO诱导的大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用.