小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选

目的　构建小鼠MPI基因的基因打靶载体转染ES细胞 ,构建用于同源重组筛选的对照载体。方法根据计算机分析小鼠MPI基因的基因组序列 ,构建用于同源重组载体的长臂和短臂并且转染小鼠ES细胞 ,经抗性筛选后得到阳性克隆 ,抽提基因组DNA后用PCR的方法进行重组子的初步筛选。结果　成功构建了MPI基因的基因打靶载体并且摸索了用PCR的方法进行重组细胞初步筛选的方法。结论　这个载体的构建为MPI基因功能的研究打下了基础 ,同时用PCR方法进行初步筛选大大减少了Southern杂交的工作量 ;利用实验小鼠来研究印迹基因是非常有效的方法 ,它不仅能了解印迹基因在小鼠生长发育过程中的功能 ,而且进而有助于研究人的相应印迹区。     

BALB/c小鼠MHCⅠ类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的：构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子的逆转录病毒表达载体。研究：用RT－PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCⅠ类分子H－2Dd的编码基因，克隆于载体pGEM-T中。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV，构建pMSCV-H2Dd4重组逆转录病毒表达质粒，并进行酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定证实，H－2Dd基因正确插入载体pMSCV,H-2Dd的编码基因经序列测定证实，与文献报道完全一致，阅读框架与设计相符。结论：成功构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础。     

rsistin基因的克隆及载体的构建

目的:克隆小鼠resistin基因及其连载体的构建,为进一步研究resistin的功能打下基础。方法:根据报道的小鼠resistin基因的全长mRNA序列为目的基因,即提取小鼠脂肪组织中的RNA,以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,逆转录(RT)合成resistinDNA,再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶链反应(PCR)扩增resistin cDNA,将扩增PCR产物(resistin cDNA)经纯化后与A-T连接于pGEM-T载体,重组质粒转化JM109感受态菌,蓝白斑筛选阳性菌落,摇菌、提取质粒。结果:提取的总RNA纯度A260/280为1.9,电泳条带28s∶18s比例约为2∶1,RT-PCR与欲扩增的目的片段的理论长度363bp相符,重组质粒插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。结论:成功克隆了小鼠resistin cDNA基因,为构建resistin基因打下基础。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体的构建

目的 构建小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为建立TDO2基因条件性敲除小鼠奠定基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理,设计并构建单链向导RNA(sgRNA)和Donor载体,以TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)转录本的外显子3作为敲除区,在打靶基因两侧各放置一个Loxp元件,建立条件性敲除TDO2第3号外显子的条件性基因打靶载体。将CRISPR/Cas9复合体和Donor载体显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,获得阳性F0小鼠,再将阳性F0代小鼠与C57BL/6小鼠交配获得F1代小鼠,并经PCR和基因测序鉴定F1代小鼠基因型。结果 结果证实所构建的TDO2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求,成功繁育并鉴定出B6/JGpt-TDO2^em1Cflox/Gpt小鼠。结论 成功构建了小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为后续进一步构建TDO2基因条件敲除小鼠奠定了基础。     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

人骨保护素编码区基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人骨保护素（OPG）编码区基因并构建其真核表达载体。方法以人骨肉瘤细胞系MG63总RNA为模板,采用RT-PCR方法获取OPG编码区基因核苷酸序列,应用定向克隆技术,构建真核表达载体pcDNA3.1-OPG-IRES-EGFP。结果获取的OPG编码区全长核苷酸序列与文献报道的完全一致,经PCR和多酶切鉴定证实构建的表达载体正确。结论获得了人骨保护素（OPG）编码区基因,并成功构建了其真核表达载体。     

耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建

目的 克隆烟曲霉耐热植酸酶基因，构建分泌性的真核表达质粒，以获取耐热的基因工程植酸酶。方法 提取烟曲霉菌的基因组，以此为模板PCR扩增成熟肽编码序列，双酶切后与包含黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和基因片断的真核表达栽体pYG1．2相连接，转化入大肠杆菌DH5a，从转化菌株中提取质粒进行序列测定和分析。结果 PCR扩增出1326bp的植酸酶编码序列，插入pYG1．2质粒中，构建了重组质粒，重复实验结果表明，该植酸酶基因序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列有2个碱基的差异，编码的蛋白质序列有99．8％的同源性。结论 成功构建了用于黑曲霉菌真核表达耐热植酸酶的重组质粒。     

苦瓜MAP30基因的克隆与载体构建

目的对苦瓜中MAP30基因进行克隆,并采用基因工程手段构建植物表达载体。方法从苦瓜中提取基因组DNA,根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计1ST-S、1ST-A、2nd-A 3个引物,并添加了SEKDEL序列、Kozak序列和组氨酸标签,采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量在800~1 000 bp之间的片段,回收克隆测序。结果克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,对PCR检测阳性的质粒进行测序分析,目的基因已成功连接到pBI121载体上,构建成植物表达载体。结论成功构建MAP30基因植物表达载体,为将MAP30基因转入番茄、烟叶中,进一步大量获得MAP30奠定基础。     

VCAM-1基因的克隆及VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体的构建

目的克隆人血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1) cDNA全长,并构建VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体.方法采用半巢式RT-PCR从人脐静脉内皮细胞系HUV-EC-C中分三段扩增得到VCAM-1cDNA片段,采用重叠延伸剪切技术(SOE)并经SacⅠ酶切、T4连接酶连接获得VCAM-1完整片段,克隆至pcDNA3.1( )真核表达载体,得到VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体.结果酶切及测序结果证明VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体构建成功.结论成功扩增人VCAM-1基因,构建VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体,为探索VCAM-1修饰人脐血基质细胞(human umbilical cord blood stromal cell,hUCBSC)重建造血微环境奠定了实验基础.     

鼠高迁移率族蛋白1A盒基因的克隆和原核表达

目的:克隆小鼠高迁移率族蛋白1A盒(HMGB1 A box)cDNA,并在大肠杆菌中表达GST-A盒融合蛋白。方法:从鼠肺提取总RNA,经RT-PCR获得HMGB1 A盒基因。将该基因插入pGEX-4T-2载体的BamHI和EcoRI位点之间并测序鉴定,转化BL21(DE3)后30℃IPTG诱导表达5h,进行SDS-PAGE分析。结果:DNA测序证明,获得了HMGB1 A盒基因,其序列与GenBank中报道序列基本一致。SDS-PAGE分析表明,HMGB1 A盒与GST融合蛋白获得成功表达,分子质量约36KD,表达量约占菌体总蛋白的15%,结论:通过RT-PCR成功克隆和表达了鼠HMGB1 A盒基因。     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建

【目的】克隆人血管生成素-1基因，并构建原核、真核表达载体。【方法】提取人骨髓中的总RNA，反转录成eDNA，利用巢式PCR技术扩出人血管生成素-1基因片段，并克隆到PQE-31、B7载体中。【结果】克隆了正确的人血管生成素-1基因，构建了PQE31 Ang-1、B7Ang-1载体。【结论】人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建，为进一步研究其功能、活性和应用奠定了基础。     

hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建

目的证实人牙乳头细胞中OP-1的表达,获得hOP-1全长基因及其高效真核表达载体.方法提取人牙乳头细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增hOP-1全长基因并克隆入T载体,筛选阳性克隆进行序列测定后.构建高效真核表达载体pCI/OP-1并筛选鉴定.结果 PCR扩增得到一特异性的约1 300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.构建的pCI/OP-1质粒,用于基因转染纯度较好.结论人牙乳头细胞中首次克隆到hOP-1全长基因,并构建获得该基因高效真核表达载体.     

人类TAP1基因克隆及表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1的构建

目的 克隆TAP1(抗原处理相关转运1)基因cDNA序列,构建其真核表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA-TAP1。方法 从人类B-LCL细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增TAP1基因片段,将该段基因克隆到表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA上测序。结果 通过RT-PCR扩增获得1个2593bp的DNA片段,测序分析表明为TAPl基因。结论 通过RT-PCR等技术成功克隆出人类TAP1基因并成功构建了表达载体peDNA3．1／VS-His TOPO TA-TAP1。     

SM6和CW2在广西壮、瑶族人群中的遗传多态性分析

目的:探索与多囊肾病基因PKD1连锁相关的微卫星SM6和CW2在广西壮、瑶两个主要少数民族人群中的多态性分布规律及其在基因诊断中的有效性.方法:采用PCR体外扩增SM6和CW2两个位点的DNA片段,然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等位基因,以标准DNA片段为标识进行比较,作直线回归计算等位基因片段的大小.结果:在SM6位点,被检的63名壮族人和64名瑶族人,分别分离出23种和28种等位基因,片段长度在88～158 bp和84～152 bp之间,其多态信息含量(PIC)分别为0.898和0.931;而在CW2位点,两个民族人群分别检测到了25种和24种等位基因,片段长度在105～157 bp和109～163 bp之间,其PIC分别为0.926和0.931.结论:两个民族在SM6位点和CW2位点的等位基因分布不相同,SM6和CW2均可用于广西壮、瑶族人群PKD1基因诊断.     

小鼠Ar18a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a的构建

目的:克降小鼠Ar18a(mAr18a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mAr18a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达.方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mAr18a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序.然后将mAr18a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒卜清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mAr18a的表达.结果与结论:成功克隆了mAr18a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a,该载体可有效将Ar18a基因转移到骨髓米源的树突状细胞中,转染效率达28.3%.     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.