挫伤性视网膜病变大鼠P53基因表达与光感受器细胞凋亡的关系

目的 观察鼠眼挫伤性视网膜病变后不同时间点视网膜感光细胞的改变及凋亡相关基因p53的表达.方法 自由落体法制作视网膜挫伤模型.49只SD大鼠随机分为正常对照组和视网膜挫伤组,后者又按照挫伤后时间的不同分为1 h、4 h、1 d、3 d、7 d、14 d组,每只大鼠左眼为实验眼,右眼为实验对照眼.行HE染色观察大鼠视网膜组织的病变情况;TUNEL法检测感光细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测视网膜组织中p53的表达.结果 TUNEL染色显示正常对照组及实验对照组大鼠视网膜组织未见凋亡阳性细胞.视网膜挫伤后3 d视网膜内可见较多阳性表达的细胞,分布在外核层.挫伤后1h、4 h、1 d、7 d、14 d,大鼠视网膜组织均未见到凋亡细胞.p53在挫伤后4 h即有表达,分布在外核层,随时间延长表达逐渐增加,至挫伤后3 d达高峰,至挫伤后7 d、14 d未见阳性表达.挫伤后4 h、1 d和3 d,视网膜p53阳性细胞光密度值(OD值)差异比较有显著性意义(P＜0.01).正常对照组及实验对照组大鼠视网膜组织未见p53阳性表达.结论 大量感光细胞的凋亡是挫伤性视网膜病变的重要机制之一,p53基因的表达可能介导了光感受器细胞凋亡的过程.     

大鼠视网膜缺血再灌注损伤后脑源性神经生长因子对细胞凋亡及caspase-2和caspase-3表达的影响

目的:探讨caspase-2和caspase-3在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达与细胞凋亡的关系及脑源性神经生长因子对其的影响及对视网膜的保护作用。方法:实验于2007-02/2007-07在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型,28只大鼠随机分为正常组和手术组,其中手术组大鼠左眼为缺血再灌注组,右眼为治疗组(BDNF玻璃体腔注射),手术组又按照再灌注后不同时间段分为1,6,12,24,48,72h组。光学显微镜观察并计数视网膜神经节细胞的数量。应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测视网膜神经节细胞凋亡、免疫组织化学法(SABC)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测视网膜组织中caspase-2和caspase-3的表达情况。结果:正常视网膜未见凋亡细胞表达,缺血后6～24h可见大量凋亡细胞表达,48h开始下降。凋亡细胞在缺血后24h达到高峰,caspase-2缺血6h后逐渐增加,24h达高峰,然后在48至72h下降。caspase-3表达改变与caspase-2改变基本一致。BDNF治疗组各观察指标表达变化规律与缺血组基本一致,但能明显抑制凋亡细胞的表达,同时使caspase-2和caspase-3的表达降低。结论:视网膜缺血再灌注损伤诱导了神经节细胞的凋亡;BDNF可抑制caspase-2和caspase-3的表达,减少神经节细胞凋亡,对视网膜缺血再灌注损伤有治疗作用。     

急性心肌缺血诱发应激反应对大鼠视网膜细胞凋亡的影响

目的 采用细胞凋亡率和半胱氨酸天冬蛋白酶3(caspase-3)活性为观察指标,观察急性心肌缺血诱发机体急性应激反应对大鼠视网膜细胞凋亡的影响. 方法 将健康成年雄性SD大鼠24只分为两组.对照组:穿线不结扎冠状动脉;冠状动脉结扎组:结扎冠状动脉左前降支.每组根据观察时点又分为3h、6h两个亚组.在预定时间分别取大鼠一眼做石蜡切片后进行TUNEL染色;取另一眼视网膜,进行caspase-3活性检测.TUNEL染色以凋亡指数(染色阳性细胞占所计数细胞总数的百分比)表示,Caspase-3采用活性表示. 结果 与对照组比较,结扎冠状动脉3h、6h视网膜细胞凋亡指数均明显升高(P=0.004,P<0.05),且阳性细胞主要出现于视网膜的神经节细胞层和内核层;Caspase-3活性均明显升高(P=0.001,P<0.05). 结论 急性心肌缺血诱发的急性应激反应可引发大鼠视网膜细胞凋亡增加,凋亡主要出现在视网膜神经节细胞层和内核层.     

自发性高血压大鼠缺血再灌注后视网膜毛细血管细胞凋亡及p53基因表达

目的 探讨凋亡相关基因p53在自发性高血压大鼠(SHR)视网膜缺血再灌注损伤（RIR）后视网膜毛细血管细胞凋亡中的作用。方法 将60只SHR随机分为假手术组(SHR-SH)和缺血组(SHR-RIR),每组各30只大鼠;每组又按照不同再灌注时间分别再分为再灌注后2、6、24、72 h和7 d共5个小组,每小组各6只大鼠。选取60只Wistar-Kyoto大鼠（WKY）同样分为假手术组(WKY-SH)和缺血组(WKY-IIR)作为对照。建立大鼠RIR损伤动物模型,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口翻译法（TUNEL）法观察大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡,通过免疫组织化学链酶卵白素-生物素复合体法(SP)检测RIR后不同时段视网膜组织中p53基因的表达变化。结果 SHR视网膜毛细血管细胞凋亡率在RIR后2、6、24、72 h和7 d时分别为（8.64±0.56）%、（14.92±0.99）%、（24.72±2.98）%、（16.53±1.80）%和（7.12±1.10）%。SHR视网膜毛细血管在RIR后2 h p53表达即开始增加,6 h继续增多,24 h达到高峰,72 h仍维持在较高水平,7 d时仍有少量表达,与SHR SH比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。WKY-SH和SHR-SH组各时间点细胞凋亡和p53表达无明显差异。WKY RIR与SHR RIR相应时间点比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 p53可能通过诱导或促进细胞凋亡参与大鼠RIR;高血压状态下发生RIR视网膜毛细血管细胞凋亡更为严重,且尤以缺血再灌注后24 h为著。     

MSC移植对视网膜缺血再灌注损伤中p53和caspase-2表达的影响

目的 探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植对视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemic-reperfusion injury,RIRI)后凋亡相关基因p53、caspase-2表达的影响.方法 将52只健康SD大鼠随机分为正常组(4只)、模型组(24只)、MSC移植组(24只).前房加压法建立大鼠RIRI模型.贴壁筛选法体外培养SD大鼠MSC,模型组于RIRI后1h予以玻璃体内注射PBS缓冲液,MSC移植组注射MSC.各组SD大鼠分别于RIRI后2h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h处死,免疫组织化学染色检测各组SD大鼠RIRI后p53及caspase-2的表达情况.结果 正常组各时间点未见p53及caspase阳性表达.RIRI后2h、6h、12 h、24 h、48h及72 h模型组p53阳性细胞数量分别为(20.50±1.71) mm-2、(26.98±4.23) mm-2、(31.74 ±0.58) mm-2、(50.63±0.67)mm-2、(48.02±0.69)mm-2、(38.90±0.95)mm-2,MSC移植组分别为(14.48±0.47)mm-2、(17.23±0.64) mm-2、(21.64±0.58)mm-2、(28.69 ±1.12) mm-2、(18.73±1.21)mm-2、(17.10 ±0.98)mm-2;模型组caspase-2阳性细胞数量分别为(9.20±0.54)mm-2 、(78.93 ±0.88) mm-2、(391.10±5.62) mm-2、(687.25±6.24) mm-2、(491.75±2.75) mm-2、(153.75±7.63)mm-2,MSC移植组分别为(4.23±0.36) mm-2、(58.03±5.48) mm-2、(282.25±56.82) mm-2、(588.75±9.07) mm-2、(389.75 ±8.18)mm-2、(121.75 ±3.59)mm-2;与各时间点模型组比较,MSC移植组p53及caspase-2的表达均明显减少,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 RIRI后行MSC玻璃体内注射,可抑制p53及caspase-2的表达,减少视网膜神经节细胞的凋亡,对RIRI有一定的保护作用.     

低氧条件下大鼠视网膜HIF-1α及P53的表达及相关分析

目的:探讨低氧条件下HIF-1α及P53在大鼠视网膜的表达及相关性。方法:将大鼠56只随机分为2组,每组各28只,分别饲养于常氧和50mL/L低氧仓。于饲养后0,2,6,8,12,24,48h各处死4只,分别进行光镜,电镜,免疫组化(SABC)测定HIF-1α及P53表达,并进行相关性分析。结果:HIF-1α在缺氧后2h开始表达,8h达到高峰,12～24h持续强表达,48h表达明显下降。P53在缺氧后2h开始表达,以后表达逐渐升高,24h后表达达到高峰,48h表达明显下降。HIF-1α及P53在大鼠视网膜表达呈明显正相关(R=0.902495)。电镜结果显示在视网膜缺氧6h视网膜超微结构开始变化,24h凋亡达到高峰。结论:低氧条件下HIF-1α及P53在大鼠视网膜均有表达,随着HIF-1α的表达达到高峰后P53的表达达到高峰,两者呈明显正相关。P53表达达到高峰时电镜结果显示凋亡达到高峰。     

美金胺对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究

目的探讨美金胺对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的保护作用。方法以生理盐水在前房内加压灌注制作大鼠急性高眼压模型，然后腹腔内注射美金胺或生理盐水，分为美金胺治疗组和急性高眼压对照组各20只，另设健康对照组大鼠8只。采用免疫组织化学法和脱氧核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated 2＇-deoxyuridine 5＇-triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL），检测大鼠RGCs caspase-3和凋亡细胞的表达。结果健康对照组无caspase-3与凋亡细胞表达。急性高眼压对照组在高眼压6h后视网膜出现凋亡细胞，逐渐增加至24h达高峰，后逐渐减少，72h时仅有少数凋亡细胞；caspase-3表达改变与凋亡细胞表达相似。美金胺治疗组的变化规律同急性高眼压对照组。急性高眼压6，24和72h后凋亡细胞与caspase-3的表达在3组间的差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。结论细胞凋亡可能在视网膜急性高眼压损伤过程中起重要作用，美金胺对RGCs具有保护作用。     

感觉神经对应激反应诱发的视网膜细胞凋亡的影响

目的 应用实验大鼠模型,观察感觉神经在应激反应诱发视网膜损伤中的作用.方法 采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备急性心肌缺血模型;应用辣椒素去乳鼠感觉神经的方法制备去感觉神经大鼠模型.雄性SD大鼠24只(48眼),随机分为两组(每组12只24眼):结扎冠状动脉(CAO)3h和6h组.辣椒素去神经结扎冠状动脉(D-CAO)3h和6h组.采用TUNEL染色技术和caspase-3活性测定观察各组大鼠视网膜细胞凋亡情况.结果 CAO组与D-CAO组比较,TUNEL染色D-CAO各时点组视网膜细胞凋亡水平较CAO相应时点组显著升高(P＜0.001);凋亡主要集中于视网膜神经节细胞层、内核层、外核层及色素上皮层.D-CAO6小时组的总凋亡率明显高于D-CAO3小时组.Caspase-3活性测定D-CAO各时点组较CAO相应时点组活性明显升高(P＜0.01).结论 结扎冠状动脉后,辣椒素去神经大鼠视网膜细胞凋亡水平较未去神经大鼠视网膜细胞凋亡水平明显升高.提示:感觉神经参与了急性心肌缺血伤害性刺激的感受及信息传递和调制,抑制伤害性刺激诱发的神经源性机制的激活及传导过程,感觉神经可能对急性应激反应引发的视网膜组织损伤具有保护作用.     

大鼠视网膜组织缺血再灌注后视网膜内caspase-3的表达及意义

目的 在视网膜缺血再灌注模型上,观察再灌注后视网膜内caspase-3的动态变化,探讨caspase-3与视网膜细胞凋亡的关系.方法 结扎大鼠左侧颈总动脉1 h,然后再灌注,检测再灌注后1、6、12、24、48、72 h大鼠视网膜内caspase-3的水平及视网膜细胞凋亡平均发生率.结果 再灌注后视网膜内caspase-3的表达出现在光感受器细胞层,在再灌注后1、6、12、24、48、72 h caspase-3平均光密度分别为0.067±0.004、0.923±0.045、1.962±0.377、3.793±0.860、2.039±0.427、1.332±0.109,细胞凋亡平均发生率(%)分别为1.8±0.1,7.1±0.2,18.2±1.4,34.7±2.1,22.6±0.9,16.3±0.4.结论 再灌注后大鼠视网膜caspase-3表达与细胞凋亡呈现正相关,caspase-3可以促进视网膜细胞凋亡的发生.(中国眼耳鼻喉科杂志,2006,6347～349)     

重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用

目的 制作Sprague-Dawley (SD)大鼠视网膜缺血-再灌注(RIR)损伤模型,探讨腹腔内注射重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对急性RIR损伤所致的大鼠视网膜神经元损伤的保护作用及其对热休克蛋白72(HSP72)表达的影响.方法 采用前房灌注的方式建立RIR损伤模型,灌注压110 mm Hg(1 mm Hg=0.133kPa),缺血时间1h;腹腔注射rHuEPO.78只SD大鼠随机分组:正常组6只,EPO组、EPO+槲皮黄酮组、RIR组各24只,均以右眼为实验眼.采用免疫组织化学法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)分别测定正常对照组和各实验组大鼠再灌注24h、48 h、72 h和1周视网膜中HSP72及凋亡细胞的表达,观察各组大鼠视网膜病理学改变.结果 ①正常组大鼠视网膜中HSP72表达微弱,各实验组大鼠视网膜中HSP72表达自再灌注12 h开始增强,24h达到高峰,随后逐渐减弱,72 h时表达稍高于正常.再灌注后各时间段,EPO组大鼠视网膜中HSP72表达均高于RIR组、EPO+槲皮黄酮组(P＜0.05).②正常大鼠视网膜中几乎没有凋亡细胞.再灌注后12 h,各实验组大鼠视网膜中可见凋亡细胞,24 h达高峰,48 h后凋亡细胞数逐渐减少;再灌注后各组大鼠视网膜中凋亡细胞数比正常组多(P＜0.05).③再灌注后,RIR组,EPO+槲皮黄酮组大鼠内层视网膜明显水肿,炎性细胞侵入,膜结构逐渐破坏;EPO组大鼠视网膜结构保持相对完整,炎性细胞相对较少.结论 ①HSP72在正常大鼠视网膜中表达微弱,RIR损伤后表达增多.腹腔注射EPO可以明显诱导大鼠视网膜中HSP72的表达增多.②EPO可以减少大鼠RIR损伤后视网膜细胞凋亡,减少视网膜内炎性细胞的浸润,保护视网膜结构,对视网膜具有明显的保护作用.其机制可能与使HSP72表达上调有关.(中国眼耳鼻喉科杂志,2012,12:30-35)     

黄芪注射液对模拟高海拔缺氧大鼠视网膜的影响

目的：探究黄芪注射液对模拟高海拔缺氧大鼠视网膜自由基代谢及病理学形态改变的影响。

方法：选取60只健康不伴有眼疾的SD大鼠,依照随机分组法分为黄芪注射液组(干预组)与生理盐水组(对照组),每组各30只。每组大鼠中,随机各选取6只于放入模拟舱前分别腹腔注射黄芪注射液(15mL/kg)与生理盐水(15mL/kg)。注射完30min之后放入5 000m的模拟舱,分别生存2、6、8、12、24h。出舱后立即处死并摘除眼球,用HE染色法观察视网膜形态的改变,比色法测定视网膜SOD和MDA含量。

结果：HE染色示2h时两组视网膜均无形态学改变,随着缺氧时间延长,视网膜各层水肿逐渐加剧,但干预组水肿程度低于对照组。随高海拔缺氧时间的延长,两组SOD活性均下降,组内不同时间点比较,差异均具有统计学意义(P<0.05); 两组MDA的含量均逐渐升高,组内不同时间点比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。两组SOD活性在同时间点进行比较,除2h无统计学意义,其余时间点差异具有统计学意义(P<0.05); 同时间点两组MDA含量进行比较,除2h差异无统计学意义,其余时间点差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论：黄芪注射液可以改善高海拔缺氧环境下大鼠视网膜病变的损伤程度,其机制可能与清除自由基、增强SOD的活性,减少脂质过氧化物MDA的含量、增强抗氧化能力有关。     

丝胶对糖尿病大鼠视网膜内质网应激特异性caspase-12凋亡途径的调节及其对细胞凋亡的抑制

背景 内质网应激(ERS)特异性caspase-12凋亡途径在细胞凋亡过程中发挥重要作用,细胞凋亡是糖尿病视网膜神经退行性病变的重要特征.研究证实,丝胶对视网膜神经细胞的凋亡具有保护作用,但其对糖尿病视网膜病变(DR)过程中与caspase-12凋亡途径相关的视网膜神经细胞是否具有保护作用仍有待研究证实. 目的 探讨丝胶是否能够通过影响ERS特异性caspase-12凋亡途径对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡发挥抑制作用.方法 采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素(STZ)连续腹腔内注射3d对30只2～3月龄SPF级SD大鼠制备糖尿病模型,以大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L及出现多饮、多食、多尿特点为造模成功.将24只造模成功的糖尿病模型大鼠按照计算机数字随机分配法分为丝胶治疗组和糖尿病模型组,每组12只,另取同周龄12只正常大鼠作为正常对照组.丝胶治疗组大鼠于成模后给予丝胶溶液2.4 g/(kg·d)灌胃,连续35 d.各组大鼠采用过量麻醉法处死并制备视网膜标本,采用TUNEL法检测并计算各组大鼠视网膜神经细胞的凋亡指数(AI);分别采用Western blot法和逆转录PCR技术检测大鼠视网膜中ERS标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、ERS特异性caspase-12凋亡途径和easpase-3蛋白及其mRNA的相对表达量,并对各组检测结果进行比较. 结果 大鼠糖尿病造模成功率为80％(24/36).正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组大鼠均可见视网膜神经细胞凋亡,阳性产物主要位于视网膜神经节细胞(RGCs)层和内核层,AI分别为0.028 4±0.002 3、0.215 1±0.020 9和0.1150±0.018 1,糖尿病模型组大鼠视网膜AI明显高于对照组,丝胶治疗组AI明显低于糖尿病模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).丝胶治疗组大鼠视网膜中GRP78、caspase-12和easpase-3蛋白的相对表达量分别为0.523±0.029、1.118±0.051和0.315±0.024,较糖尿病模型组的0.924±0.039、1.468±0.037和0.554±0.032均明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05),丝胶治疗组大鼠视网膜中GRP78、easpase-12和caspase-3 mRNA的相对表达量分别为0.816±0.022、0.216±0.023和0.322±0.022,较糖尿病模型组的1.218±0.033、0.407±0.012和0.531±0.029均明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 丝胶可以通过下调糖尿病模型大鼠视网膜中GRP78、caspase-12和caspase-3的表达改善内质网ERS,减少视网膜神经细胞的凋亡.     

Nogo受体在早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用

目的:探讨Nogo受体(nogo receptor,NgR)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用及机制。方法:链脲佐菌素诱导SD大鼠DM模型,实验分4组,对照组;DM组;siNgR组:DM大鼠玻璃体内给予NgR反义核苷酸序列;siRNA空白组:DM大鼠玻璃体内给予阴性核苷酸序列。1mo后TUNEL染色检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)凋亡,试剂盒检测视网膜丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,Western-blot检测视网膜NgR及caspase-3含量。结果:对照组、DM组、siRNA空白组及siNgR组MDA含量分别为3.74±0.49,7.21±0.96,6.41±1.34及4.02±0.53nmol/mg prot。与对照组相比,DM组及siRNA空白组视网膜RGC凋亡增加,NgR及caspase-3表达上调,MDA含量升高(P<0.05),而siNgR组视网膜RGC数量、NgR及caspase-3表达、MDA含量较对照组均无明显变化(P>0.05)。结论:NgR表达增加是糖尿病RGC凋亡的重要原因之一,其机制可能与NgR诱导视网膜氧化应激、上调caspase-3表达有关。     

应用OCT对衣霉素诱导视网膜损伤大鼠模型的检测评估

目的:利用光学相干断层扫描仪(OCT)评价衣霉素损伤的大鼠视网膜形态及功能形态改变.方法:SD大鼠60只,随机分为3组(每组20只):对照组、低剂量组和高剂量组,各组分别应用微量注射器行大鼠眼球玻璃体腔内注射,剂量均为0.3μL,对照组给予9g/L生理盐水、低剂量组给予浓度0.5mg/kg衣霉素、高剂量组给予浓度1.5mg/kg衣霉素进行玻璃体腔内注射.在造模后每天散瞳观察眼底,第1、7、14d 通过OCT、眼底照相、眼底荧光、视网膜电图及HE染色观察不同浓度下视网膜各层形态学变化.结果:OCT结果提示衣霉素对视网膜形态及结构有损伤作用,呈现出时间-剂量依赖性;眼底照相结果提示在衣霉素注射2wk后,随着衣霉素浓度的变化,视网膜周边及黄斑区颜色逐渐苍白,视盘区水肿,高剂量组出现视网膜血管变细,视神经萎缩;荧光素造影结果提示:衣霉素注射玻璃体腔2wk后,视网膜血管功能损伤,逐渐出现周边至中央部血管造影剂渗漏;电生理表明,衣霉素诱导的视网膜电图紊乱,a波、b波逐渐地振幅降低,甚至变平,具有明显的统计学意义(P<0.05);石蜡切片HE染色结果提示衣霉素对视网膜各层的损伤呈现剂量-时间依赖性,与OCT结果相一致.结论:衣霉素可以通过诱导视网膜损伤模拟视网膜疾病模型,OCT可以动态观察视网膜的损伤改变,作为一种非侵入性检查手段对于评价视网膜损伤具有一定积极意义.     

Peroxynitrite-induced apoptosis in photoreceptor cells

PURPOSE: To study the mechanisms of peroxynitrite-induced photoreceptor cell damage, using retinal cultures and a peroxynitrite donor, 3-morpholinosydnonimine (SIN-1). METHODS: Retinal explants obtained from 20-day-old Lewis rat pups, were exposed to SIN-1 for varying lengths of time at varying concentrations. Apoptosis in the photoreceptor cells was detected using the TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) method and a DNA fragmentation assay. Selected retinal samples were processed for an ultrastructural analysis to confirm apoptosis. The retinas exposed to SIN-1 were tested for the expression of caspase-3 by immunohistochemistry and a Western blot analysis. The retinas were also evaluated for the prevention of apoptosis in the presence of the caspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-fmk). RESULTS: The retinal explants exposed to SIN-1 showed a significant increase in the presence of TUNEL-positive photoreceptor cells. Similarly lineal increases in TUNEL-positive cells were seen in the presence of increasing concentrations of SIN-1. DNA ladder formation was seen with the exposure of SIN-1. Ultrastructurally, SIN-1 exposed retinas revealed typical apoptotic changes in the photoreceptor cell nuclei. The retinas preincubated with urate for 6 hours and exposed to SIN-1 for 16 hours showed significantly fewer TUNEL-positive cells compared to the retinas exposed to SIN-1 alone (p < 0.05). Moreover, the retinas exposed to SIN-1 showed the expression of caspase-3. This expression, as well as the number of apoptotic photoreceptors, significantly decreased in the presence of Z-VAD-fmk. CONCLUSIONS: These results show that peroxynitrite induces apoptosis in photoreceptor cells and that such retinal damage appears to be mediated by caspase-3. The apoptotic process can be minimized by peroxynitrite scavenger urate, as well as by the caspase inhibitor Z-VAD-fmk.     

遗传性视网膜变性视细胞凋亡与p53基因表达

目的 研究遗传性视网膜变性视细胞凋亡的基因调控。方法 对出生后第１３－６０天的遗传性神经网膜变性动物模型（ＲＣＳ）大鼠视网膜,进行末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导 ｄＵＴＰ末端标记（ＴＵＮＥＬ）凋恨细胞检测、ｐ５３蛋白免疫组织化学染色、ｐ５３ｍＲＮＡ原位杂交和ＲＴ－ＰＣＲ。结果 ＲＣＳ大鼠视网膜视细胞自生后第２５天出现凋亡,第３０－３５天达高峰;视细胞凋亡初期,妈隆后第２８－３０天,视细胞内Ｐ５３蛋白     

Calpain-specific proteolysis in primate retina: Contribution of calpains in cell death

PURPOSE: One of the leading causes of blindness is retinal damage caused by the high intraocular pressure (IOP) in glaucoma. Previous studies in rats have suggested that the proteolytic enzyme calpain (EC 3.4.22.17) is involved in retinal cell death during ischemia and in acute high IOP. Ubiquitous, calcium-activated calpain-1 and -2 from monkey retina are highly homologous to rat calpains, although expression patterns in variants of tissue-specific calpain-3 are different between monkey and rodent retinas. Thus, the purpose of the present study was to investigate the involvement of calpain-induced proteolysis in retinal cell death in primates. METHODS: Calpain involvement in a simulated pathologic condition was examined by incubating monkey retinas in hypoxic conditions (95% N2 and 5% CO2) in RPMI medium without glucose. Endogenous tissue calpains were also directly activated in monkey and human retinal soluble proteins by incubating with 2.5 mM calcium. The resultant proteolysis of monkey retinal proteins was assessed by 2D electrophoresis (2-DE). RESULTS: In hypoxic retina, leakage of lactate dehydrogenase (LDH) from retinas into the medium increased, indicating cell death. LDH leakage was partially inhibited by the calpain inhibitor SJA6017. Calpain autolysis was observed, and the calpain-preferred substrate alpha-spectrin was proteolyzed. In retinal soluble proteins incubated with calcium, a total of 15 spots from 2-DE of retinal soluble proteins were identified by mass spectrometry. Proteolysis of major proteins, vimentin, beta-tubulin, alpha-enolase, and Hsp70 were confirmed by immunoblot analysis. Activation of calpains and proteolysis of these substrates were inhibited by the calpain-specific inhibitor SJA6017. CONCLUSIONS: Taken together, these results suggested that calpain activation in primate retinas could play an important role in cell death during hypoxia caused by elevated IOP from glaucoma.     

白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用

目的　探讨白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用及机制。方法　将72只健康SD大鼠随机分成3组:常氧对照组、低氧模型组、低氧+白藜芦醇（resveratrol,RES）干预组（RES干预组）。常氧对照组大鼠在常氧环境下喂养,低氧模型组及RES干预组大鼠置于低压氧舱内（模拟5000 m的海拔高度）喂养,RES干预组每日并给予腹腔注射30 mg·kg^-1 RES 1次。各组大鼠在不同处理7 d后剥离视网膜,免疫组织化学法观察大鼠视网膜组织中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）的表达,RT-PCR检测核转录因子-kappaB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）mRNA的表达。结果　低氧模型组大鼠视网膜GFAP与HIF-1的表达较常氧对照组增加,BDNF mRNA（2.627±0.633）和NF-κB mRNA（1.712±0.198）的相对表达量较常氧对照组（2.000±0.518、1.053±0.483）上调（P= 0.013、0.008）。与低氧模型组对比,RES干预组视网膜受损程度减轻,GFAP与HIF-1的表达减少,BDNF mRNA相对表达量（2.053±0.938）显著下调,差异有统计学意义（P=0.024）,而NF-κB mRNA相对表达量（1.481±0.397）与低氧模型组相比,差异无统计学意义（P=0.455）。结论　RES对高海拔缺氧诱导的视网膜损伤有保护作用,其机制可能与调节GFAP、HIF-1、BDNF以及NF-κB的表达有关。     

银杏内酯B联合视网膜干细胞移植对青光眼大鼠的影响及机制研究

目的：研究银杏内酯B联合干细胞移植对青光眼大鼠的影响及相关机制。

方法：实验共分为五组：正常对照组(Control)、青光眼模型组(GLA)、干细胞组(RSCs)、银杏内酯B组(GKB)与混合组(RSCs+ GKB)。眼球组织进行HE染色,TUNEL染色检测视网膜神经节细胞的凋亡,免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax以及Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测各组组织中Bcl-2、Bax mRNA表达水平。

结果：HE染色结果显示,给予干细胞或银杏内酯B处理,减少纤维间质水肿与空泡的出现,混合组纤维间质少见水肿与空泡; 银杏内酯B联合干细胞处理后显著减少视网膜神经节细胞的凋亡,上调Bcl-2的蛋白与mRNA表达水平,并下调Bax的蛋白与mRNA表达水平、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达水平。

结论：银杏内酯B联合干细胞能够抑制青光眼大鼠视网膜神经节细胞的凋亡,改善青光眼,其作用机制可能与调控Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9因子的表达有关。     

Protective effects of triamcinolone acetonide upon the upregulation and phosphorylation of GAP 43 in an animal model of retinopathy of prematurity

Acta Ophthalmol. 2010: 88: e217–e221

Abstract.

Purpose: The aim of the current study was to investigate the effects of triamcinolone acetonide (TA) upon the expression and phosphorylation of growth‐associated protein 43 (GAP 43) in the retinas of oxygen‐induced retinopathy (OIR) rats. Methods: Oxygen‐induced retinopathy was induced by exposing Sprague‐Dawley rats to hyperoxia (80% oxygen) from postnatal (P) days 2–14 and then returning the rats to normoxic conditions. Triamcinolone acetonide or a conditioned saline (control) was injected intravitreally into the right or left eye, respectively, of OIR rats at P15. We then assessed the molecular and histological changes in the expression of GAP 43 and phospho‐GAP 43 in OIR and control rat retinas, and also after treatment with TA by RT‐PCR, Western blotting and immunohistochemistry. Results: Growth‐associated protein 43 mRNA levels were found to be increased by 1.6‐fold (p = 0.001, n = 5) in the retinas of P18 OIR rats compared with the control rats. The protein levels of GAP 43 and phospho‐GAP43 were found to be elevated in the retina of P18 OIR rats (2.40‐ and 2.39‐fold greater than each control, p<0.001, n = 5, respectively). Immunoreactivities of GAP 43 and phospho‐GAP 43 were stronger in the inner plexiform layer in OIR rat retinas compared with the control. However, treatment with TA attenuated GAP 43 and phospho‐GAP 43 upregulation in the OIR retinas. Conclusion: Our results indicate that GAP 43 and phospho‐GAP 43 participate in retinal (potentially pathologic) changes following oxygen‐induced damage. Triamcinolone acetonide protects the retinal damage in relatively hypoxic retinas of OIR rats. Therefore, TA treatment does not induce the expression and phosphorylation of GAP 43 in OIR rat retinas.