黏着斑激酶相关非激酶对肝星状细胞凋亡及细胞外信号调节激酶的影响

目的 应用黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)表达质粒瞬时转染纤维连接蛋白(FN)预刺激的肝星状细胞(HSC),探讨FRNK对HSC凋亡及细胞外信号调节激酶(ERK)的影响.方法 在体外,以FN诱导HSC增殖,采用脂质体介导的方法用FRNK表达质粒瞬时转染HSC,应用膜联蛋白/碘化丙啶双标记流式细胞术、DNA凝胶电泳技术和透射电镜技术检测细胞的凋亡,Western blot及RT-PCR方法检测FRNK、黏着斑激酶(FAK),p FAK(Tyr397)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)、ERK1、p-ERK蛋白及其mRNA表达. 结果FRNK表达质粒成功转染HSC,在翻译后水平抑制FAK磷酸化.与空质粒组比较,FRNK表达质粒转染HSC48 h后,HSC凋亡率由9.28%±1.05%增至25.37%±1.92%(P<0.01),caspase-3蛋白由185.82±9.69增至264.17±12.60(P<0.01),caspase-3 mRNA由1.07±0.27增至4.19±0.48(P<0.01).FRNK抑制FAK磷酸化和在翻译和转录水平抑制ERK1、p-ERK的表达,而FN则促进FAK和ERK1,p-ERK在翻译和转录水平的表达. 结论在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒,可使外源性的FRNK在HSC内大量表达,在翻译后水平抑制FAK磷酸化;并可能通过FAK-ERK信号转导通路诱导FN刺激的HSC发生凋亡.     

siRNA抑制IGFBPrP1表达对肝星状细胞株分泌细胞外基质的影响

目的利用化学合成的siRNA抑制肝星状细胞（HSC）中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBPrP1）基因的表达,观察其对HSC产生细胞外基质（ECM）的影响,以明确IGFBPrP1在肝纤维化中的作用地位。方法 （1）化学合成2对针对IGFBPrP1基因的siRNAs,转染肝星状细胞株HSC-T6,筛选抑制率较高的siRNA用于干扰实验;（2）将HSC-T6分为3组：正常对照组、阴性对照组和IGFBPrP1 siRNA干扰组。将筛选的抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6,Western Blot检测其IGFBPrP1、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和纤维连接蛋白（FN）的表达。采用单因素方差分析,多重比较采用SNK-q检验。结果 （1）将2对IGFBPrP1 siRNA转染HSC,筛选出能高效抑制IGFBPrP1表达的siRNA;（2）与正常对照组和阴性对照组相比,IGFBPrP1 siRNA干扰组能明显抑制IGFBPrP1、ColⅠ和FN的表达（F=48.018、81.246、43.850,P〈0.01）。结论 IGFBPrP1 siRNA能特异性抑制HSC中IGFBPrP1的表达,进而使HSC中ECM的重要成分ColⅠ和FN合成和分泌减少,故IGFBPrP1可在肝纤维化中起有重要作用。     

抑制细胞因子RhoA的表达对肝星状细胞株HSC-T6胶原分泌的影响

目的:观察并比较两种方法抑制RhoA的表达对细胞外基质成分,如Ⅰ型胶原、透明质酸以及层粘连蛋白合成的影响,为肝纤维化的基因治疗寻求新的途径.方法:设计并合成针对RhoA相同靶点的反义寡核苷酸和小干扰RNA.分别转染肝星状细胞株HSC-T6,逆转录PCR技术检测细胞中RhoA和Ⅰ型胶原mRNA的表达:Western blot检测细胞中RhoA蛋白质的表达;ELISA检测培养上清中透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)及PIIIP的含量.结果:转染RhoA反义寡核苷酸和小干扰RNA Ratl质粒后.HSC-T6中RhoA mRNA的表达分别由0.892±0.051、0.937±0.044降为0.113±0.024、0.212±0.042;蛋白质表达水平均明显下调;细胞内Ⅰ型胶原mRNA的表达分别由0.709±0.067、0.695±0.087降为0.436±0.037、0.201±0.044;细胞外基质成分如HA、LN及PIIIP的表达水平明显下降.两者相比,小干扰RNA具有更强的生物学效应.结论:靶向抑制细胞因子RhoA的表达可明显减少肝星状细胞株HSC-T6细胞外基质的合成,且小干扰RNA的效果明显优于针对同一靶点的反义寡核苷酸,显示RNAi技术应用于肝纤维化基因治疗的良好前景.     

粘着斑激酶相关非激酶质粒转染抑制肝星状细胞周期进程及机制研究

粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化后，对多种类型细胞的生物学行为具有重要影响，如促进增殖，正性调控细胞周期，增强粘附、迁移，控制凋亡等。粘着斑激酶相关非激酶（FAK—related non-kinase，FRNK）是FAK的内源性抑制剂。本研究应用体外细胞培养技术，以纤维连接蛋白（fibronectin，FN）刺激肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）增殖，在脂质体介导下瞬时转染FRNK质粒，探讨选择性阻断FAK磷酸化对HSC增殖周期及细胞周期相关蛋白的影响。     

肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究

目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率.方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA 干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com（含有CTGF和TIMP-1）,进行酶切和测序鉴定.将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率.结果酶切与测序结果提示重组质粒 psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF ＋TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组（Com组,20±2%,P〈0.05）;在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF＋TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%（P〈0.05）.结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高.     

重组结缔组织生长因子shRNA质粒的构建及其对肝星状细胞基因表达的影响

[目的]构建同时干扰大鼠结缔组织生长因子(CTGF)2个不同基因位点的shRNA质粒,并将其转染肝星状细胞(HSC),研究其对CTGF基因表达的影响。[方法]针对大鼠CTGF mRNA靶向序列设计并合成2对DNA模版序列,用PCR的方法将2条CTGF靶向特异性的shRNA分别链接到质粒pGenesil1.2载体的U6启动子和H1启动子。将构建的干扰质粒以阳离子脂质体法转染HSC-T6细胞,应用RT-PCR及Western Blot检测CTGF的表达。[结果]成功构建CTGF shRNA重组质粒;通过RT-PCR和Western Blot分析发现干扰质粒组的CTGF mRNA与蛋白表达水平明显下降(P0.05)。[结论]重组CTGF shRNA能有效抑制HSC中CTGF的表达。     

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。     

小分子干扰RNA沉默高迁移率族蛋白B1抑制肝星状细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成*

目的 研究小分子干扰RNA（siRNA）干扰高迁移率族蛋白B1（HMGB 1）表达对肝星状细胞（HSC） Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响。方法 将化学合成的HMGB 1基因特异性siRNA以脂质体包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照,抽提细胞总RNA和蛋白质,采用Western blot法检测细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达情况;采用细胞免疫荧光法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达与定位;采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平。结果 转染HMGB 1基因特异性siRNA的HSC-T6细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白水平显著下调,免疫细胞化学检测也提示转染siRNA 后细胞内Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平较对照组明显降低;在培养72 h时,上清液Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原水平分别较对照组下降了（46.36±3.82） %和（41.92±3.58） %（F=33.14,P<0.01;F=27.56,P<0.01）。结论 HMGB 1特异性siRNA能高效抑制HSC-T6细胞胶原的合成和分泌,因而可能具有预防和治疗肝纤维化的潜力。     

靶向胰腺癌PANC-1细胞整合素连接激酶基因RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的:构建整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组质粒并检测其对胰腺癌PANC-1细胞ILK基因表达的干扰效率,为进一步研究胰腺癌中ILK基因功能奠定实验基础和理论依据.方法:设计并构建3条含有针对ILK基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列的重组质粒并进行DNA测序.通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418压力筛选至得到稳定转染细胞克隆,利用Real-Time PCR和Western blot检测ILK基因的表达抑制情况.筛选出干扰效率最高的重组质粒.结果:经DNA测序证实胰腺癌PANC-1细胞ILK基因的R NA干扰重组质粒构建成功;重组质粒稳定转染Panc-1细胞后(各组转染效率均>90%),各实验组ILK基因表达均被有效地抑制,其中重组质粒-2的干扰效率最高,其mRNA及ILK表达显著下调,其抑制率分别为93.01%和65.69%;ILK mRNA表达较阴性对照组、空质粒组表达量显著下降(0.090±0.009vs 1.147±0.110,1.005±0.121,P<0.01).结论:成功构建ILK基因RNA干扰重组质粒,重组质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞ILK基因表达.为进一步研究ILK在胰腺癌中的基因功能奠定基础.     

靶向survivin的小干扰RNA对HCCLM6细胞恶性表型的影响

目的 研究survivin基因在肝癌细胞中的表达水平及survivin小干扰RNA对高侵袭潜能人肝癌细胞HCCLM6恶性表型的影响.方法 收集4种人肝癌细胞株,以RT-PCR和Western blot检测survivin蛋白质表达,进而筛选出高表达survivin基因的肝癌细胞.构建针对survivin mRNA的干扰质粒pshRNA-survivin及阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-NC,并将其转染HCCLM6细胞.实时荧光定量PCR检测survivin mRNA表达量的变化情况;肿瘤细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变及Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭力的改变. 结果 4种肝癌细胞随侵袭能力升高survivin mRNA表达水平依次升高(P＜0.05),HCCLM6细胞survivin表达水平最高;Western blot结果与RT-PCR结果一致.HCCLM6细胞转染pshRNA-survivin后,survivin mRNA表达量明显下降,抑制率达93.500%±3.117%,与转染阴性对照质粒组(8.215%±0.797%)相比,差异有统计学意义(t=70.852,P＜0.01).细胞黏附实验结果显示,survivin重组质粒转染组黏附率为11.403%±1.256%,阴性对照组为32.545%±1.367%(t=20.732,P＜0.01).Matrigel侵袭实验结果显示,与阴性对照组[(32.6±1.4)]个相比,转染pshRNA-survivin后,细胞侵袭力明显下降[(13.5±0.9)个,t=14.5,P＜0.01].结论 Survivin与肝癌侵袭转移等恶性生物学行为有关,并随侵袭转移潜能升高表达水平升高.pshRNA-survivin可以特异性抑制高侵袭肝癌细胞HCCLM6中survivin表达,并显著降低其侵袭、黏附能力,小干扰RNA技术有望成为抑制肝癌侵袭转移的新途径.     

ShRNA-mediated BMI-1 gene silencing inhibits gastrointestinal stromal tumor cell telomerase activity and enhances apoptosis

Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most frequently occurring mesenchymal tumors of the gastrointestinal tract. Telomerase activity is well acknowledged as a critical factor in oncogenesis. The objective of the present study is to evaluate the effect of BMI gene silencing on proliferation, apoptosis and telomerase activity in human GIST882 cells. GIST882 cells were transfected with a eukaryotic expression vector of an shRNA fragment. The silencing efficiency in the GIST882 cells was determined by RT-qPCR and a western blot analysis. After the shRNA-BMI-1 plasmid was transfected into the GIST882 cells and nude mice, a cell counting kit-8 (CCK-8) assay and flow cytometry were utilized to detect the GIST882 cell proliferation, the apoptosis rate and the cell cycle. Tumor growth was observed by tumor xenograft in nude mice. Telomerase activity and telomere length were detected by a Southern blot and a target region amplified polymorphism. The shRNA-BMI-1 recombinant plasmid was successfully constructed. The mRNA and protein expression of the BMI-1 gene in GIST882 cells was suppressed by the shRNA-BMI-1 recombinant plasmid. Meanwhile, BMI-1 gene silencing inhibited the cell proliferation, tumor growth, and cell cycle in the GIST882 cells. However, cell apoptosis was increased and telomerase activity was decreased with the silencing of the BMI-1 gene. Collectively, the results of this study suggest that silencing the BMI-1 gene may provide a new target for the treatment of GISTs.     

半乳糖凝集素-3对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达,设计合成galectin-3小干扰片段,筛选有效片段构建质粒,转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99,并设立对照组和空质粒转染组,RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达.活细胞计数法观察干扰后24、48,72 h各组细胞增殖情况;Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测转染72 h后各组细胞凋亡情况.组间比较用LSD法t检验进行统计学分析.结果 rHSC-99细胞表达galectin-3;成功构建pG Csilencer U6/Neo/GFP/shRNA,并经测序验证正确.转染效率为40%～50%,RT-PCR结果显示:RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%(F=136.432,P＜0.01),Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%(F=144.842,P＜0.01).干扰后48 h和72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%(F=4.425,P=0.010)和37.5%(F=4.415,P=0.018);干扰72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组:早期凋亡率增加155.2%,与对照组比较,F=27.588,P＜0.01;晚期凋亡率增加56.9%与对照组比较,F=12.798,P＜0.01.结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3;RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡.     

Specific shRNA targeting of FAK influenced collagen metabolism in rat hepatic stellate cells

AIM:To investigate the effects and mechanism of disruption of focal adhesion kinase(FAK) expression on collagen metabolism in rat hepatic stellate cells(HSC).METHODS:The plasmids expressing FAK short hairpin RNA(shRNA) were transfected into HSC-T6 cells,and the level of FAK expression was determined by both real-time quantitative polymerase chain reaction(QPCR) and Western blotting analysis.The production of type collagen and type collagen in FAK-disrupted cells was analyzed by real-time Q-PCR.The level of ...     

半乳糖凝集素-3对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达,设计合成galectin-3小干扰片段,筛选有效片段构建质粒,转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99,并设立对照组和空质粒转染组,RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达.活细胞计数法观察干扰后24、48,72 h各组细胞增殖情况;Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测转染72 h后各组细胞凋亡情况.组间比较用LSD法t检验进行统计学分析.结果 rHSC-99细胞表达galectin-3;成功构建pG Csilencer U6/Neo/GFP/shRNA,并经测序验证正确.转染效率为40%～50%,RT-PCR结果显示:RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%(F=136.432,P＜0.01),Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%(F=144.842,P＜0.01).干扰后48 h和72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%(F=4.425,P=0.010)和37.5%(F=4.415,P=0.018);干扰72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组:早期凋亡率增加155.2%,与对照组比较,F=27.588,P＜0.01;晚期凋亡率增加56.9%与对照组比较,F=12.798,P＜0.01.结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3;RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡.     

shRNA沉默Kir6.2基因表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建shRNA体内表达载体pGenesil-3-shRNA,研究抑制Kir6.2基因表达对HepG2细胞增殖和侵袭的影响. 方法 以Kir6.2基因为目的 基因,以产生shRNA质粒载体pGenesil-3为表达模板,细胞内转录合成2条shRNA.重组质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定和测序后,使用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞.实验分为SK组(未转染)、SK-HK组(阴性对照),SK-K1(转染干扰序列1)组和SK-K2(转染干扰序列2)组.G418筛选出荧光单克隆进行培养.Westernblot检测Kir6.2蛋白在各组细胞中的表达.MTT法和Transwell系统分别检测各组细胞的增殖和侵袭能力. 结果 经酶切、测序鉴定,重组质粒符合设计要求.Western blot检测结果显示SK组,SK-HK组、SK-K1组和SK-K2组Kir6.2蛋白质相对表达量分别为0.9349±0.0443,0.9098±0.0195,0.2869±0.0295,0.3256±0.0341;和对照组相比,实验组Kir6.2蛋白减少.MTT法检测SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组细胞的增殖分数分别为0.7523±0.0681,0.7351±0.0589,0.2494±0.0485,0.2261±0.0298,F=0.2401,P=0.000.Transwell实验结果显示,SK组、SK-HK组,SK-K1组、SK-K2组细胞的穿膜数分别为47.0±7.1,40.7±8.0,14.3±5.1,15.0±3.7,F=-30.74,P=0.000.和对照组相比,实验组HepG2细胞增殖和侵袭能力均明显降低.结论 抑制HepG2细胞Kir6.2基因的表达可降低HepG2细胞的增殖和侵袭能力.     

RNA干扰沉默HIF-1α基因对舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移的影响

目的 观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α （HIF-1α）基因对人舌癌细胞Tca8113侵袭和迁移的影响.方法 将3个shRNA序列质粒导入pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA质粒表达载体,并将重组质粒经脂质体介导转染人舌癌细胞Tca8113（siHIF-1α组）,转染阴性对照质粒的细胞作为空载组.半定量RT-PCR及Western blot法检测HIF-1α的mRNA及蛋白,细胞侵袭实验和划痕实验检测Tca8113的侵袭和迁移能力,同时采用Western blot法检测其上皮-间质转化（EMT）相关标志蛋白和黏着斑激酶（FAK）、磷酸化FAK（P-FAK）.结果 测序证实成功构建了HIF-1α shRNA重组质粒（分别为sh1、sh2、sh3）,将sh3,转染Tca8113后进行低氧培养,HIF-1α基因表达显著被抑制.与空载组相比,转染sh3的siHIF-1α组穿透Matrigel胶的细胞数明显减少,且迁移能力也显著下降,两组相比,P均＜0.05.与对照组（未转染质粒的Tca8113）相比,siHIF-1α组EMT相关标志蛋白和p-FAK蛋白表达下降,两组相比,P均＜0.05.结论 RNA干扰沉默HIF-1α基因能有效抑制舌癌细胞的侵袭和迁移,在一定程度上可以逆转舌癌细胞的恶性表型.     

Effect of RNA Interference Inhibiting the Expression of the FUBP1 Gene on Biological Function of Gastric Cancer Cell Line SGC7901

Background: The research aimed to observe the effect of gene silencing on the proliferation, migration, cell cycle, apoptosis, and other biological functions of human gastric cancer cells with RNA interference inhibiting the expression of the far upstream element-binding protein 1 (FUBP1) in the gastric cancer cell line SGC7901.Methods: The shRNA lentivirus vector of the target gene FUBP1 was constructed to transfect the gastric cancer cell line SGC7901. The qRT-PCR and western blot assays were used to detect the expression levels of FUBP1 mRNA and protein in the gastric cancer cells. The CCK-8 assay was used to detect the proliferation of gastric cancer cells. The cell scratch assay and the transwell assays were used to detect the migration of gastric cancer cells. Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution and apoptosis.Results: The shRNA lentiviral vector of FUBP1 was successfully transfected into the gastric cancer cell line SGC7901, and could effectively reduce the expression of mRNA and protein of FUBP1. The silencing of FUBP1 could inhibit the gastric cancer cell proliferation and affect the distribution of the cell cycle, resulting in S-phase arrest and cell growth inhibition. However, FUBP1 silencing has no significant effect on cell apoptosis and migration.Conclusions: The expression of FUBP1 can be inhibited specifically and effectively by RNA interference technology, which can significantly affect the biological function of the gastric cancer cell line SGC7901.