k阿片激动剂的致心律失常作用涉及百日咳毒素敏感的G蛋白机制

目的：探讨百日咳毒素（ＰＴＸ）敏感的Ｇ蛋白是否介导ｋ阿片激动剂的心脏效应，方法：应用离体大鼠心脏Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流模型观察ｋ阿片激动剂Ｕ５０４８８Ｈ的心脏作用并探讨其可能机制。结果：研究结果表明：Ｕ５０４８８Ｈ可导致心律失常，降低心率，心肌收缩力量和冠脉流量；ＭＲ２２６６和百日咳毒素（ＰＴＸ）预处理后，可取消Ｕ５０４８８Ｈ的致心律失常作用，但不能取消其降低心肌收缩力量和冠脉流量的作用，结论     

κ阿片受体在抗缺血/再灌注大鼠心律失常中的作用机制

目的研究κ阿片受体在抗缺血/再灌注性心律失常中的作用机制,并初步探讨κ阿片受体选择性激动剂U50488H(U50)对大鼠血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素(ET)和一氧化氮(NO)的调控作用。方法实验大鼠随机分为7组,即对照组(Control),缺血再灌注组(I/R),U50+I/R组,PTX组(pertussis toxin,百日咳毒素,G i/o蛋白抑制剂),G lib组(glibenc lam ide,KATP通道阻断剂),Che组(chel-erythrine,PKC选择性抑制剂)和Gen组(gen iste in,酪氨酸激酶TK抑制剂),观察心律失常发生情况并计算心律失常评分;检测血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素(ET)和一氧化氮(NO)水平。结果①与I/R组相比,U50488H+I/R组大鼠心律失常评分明显下降,该作用可被选择性κ阿片受体阻断剂nor-BNI阻断。②分别提前给予PTX,glibenc lam ide和chelerythrine后,U50488H的抗心律失常作用可被明显减弱或阻断;③提前给予gen iste in对U50488H的抗心律失常作用无明显影响。④与正常大鼠血浆AngⅡ、ET和NO含量比较,I/R组血浆AngⅡ和ET含量明显增加,NO含量明显降低;给予U50488H处理后,U50+I/R组大鼠血浆AngⅡ和ET含量比I/R组降低,而NO含量则明显升高。结论①κ阿片受体介导了抗缺血/再灌注性心律失常的作用,该作用的信号转导途径可能涉及G i/o、PKC和KATP等通道。②激活κ阿片受体还可能通过下调大鼠血浆AngⅡ和ET或上调NO等因子的水平来发挥抗心律失常作用。     

慢性吗啡处理大鼠心脏对κ激动剂的反应

本研究观察了大鼠接受慢性吗啡处理过程中，心脏中κ受体结合位点的变化及其对κ激动剂ＵＳ５０４８８致心律失常作用的反应。结果表明，在慢性吗啡处理过程中，心脏κ结合位点数目逐渐增加，至ｄ１０超过对照一倍以上；同时在慢性处理ｄ８和ｄ１０，鼠心对Ｕ５０４８８Ｈ的致心律失常效应出现明显的耐受。撤药后２ｄ，鼠心κ结合位点与其对κ激动剂的效应回复至对照水平，结果提示，大鼠的μ阿片耐受可引起心脏κ受体兴奋后反应的改变。     

κ－阿片激动剂增高心室易颤性及其机制

研究结果表明，在离体心脏Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ模型，κ－阿片激动剂Ｕ５０４８８Ｈ可降低心室颤动阈（ＶＦＴ）、有效不应期（ＥＲＰ）和舒张期兴奋阈（ＤＥＴ）；且可被特异。桔抗剂ＭＲ２２６６所阻断。硝苯吡啶和细胞外低钙预处理可取消Ｕ５０４８８Ｈ的心脏作用。Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ预处理可取消Ｕ５０４８８Ｈ对ＥＰＰ和ＤＥＴ的作用，但不能取消其降低ＶＦＴ的作用、结果提示，Ｕ５０４８８Ｈ激活κ－受体具致心律失常作用，这一作用主要依赖于跨膜钙内流。     

k－阿片激动剂致心律失常作用的钙依赖性

本研究观察了ｋ－阿片激动剂Ｕ５０，４８８Ｈ致心律失常作用对细胞外、内钙的依赖性。结果表明，Ｕ５０，４８８Ｈ可引起心室颤动阈（ＶＦＴ）、舒张期兴奋阈（ＤＥＴ）降低和有效不应期（ＥＲＰ）缩短。硝苯吡啶和细胞外低钙可取消Ｕ５０，４８８Ｈ的心脏作用；Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ预处理不能取消Ｕ５０，４８８Ｈ降低ＶＦＴ的作用，但可对抗其对ＥＲＰ和ＤＥＴ的作用。提示Ｕ５０，４８８Ｈ的致心律失常作用主要依赖于钙的跨肌膜内流。     

阿片受体激动剂U50,488H通过Cx43介导的抗心律失常作用与抑制钙通道有关

目的研究U50,488H(选择性κ阿片受体激动剂)是否通过抑制钙通道减少外钙内流参与了κ阿片受体的抗缺血性心律失常作用。方法将30只SD大鼠完全随机设计分为5组(每组6只):对照组(Sham)、缺血组(Isc)、缺血+U50,488H组(Isc+U50)、缺血+U50,488H+钙离子通道激动剂Bay k8644组(Isc+U50+Bay)、缺血+Bay k8644组(Isc+Bay)。建立大鼠急性心肌缺血模型,施行30 min心肌缺血前应用U50,488H(1.5 mg.kg-1)及Bay k8644(66.7μg.kg-1)进行干预,观察各组心律失常发生情况及连接蛋白43(Cx43)在蛋白和基因水平表达的变化。结果①在体动物模型中,Bay k8644可以翻转U50,488H激活κ阿片受体后产生的抗心律失常作用(P<0.05)。②在蛋白表达水平,Bay k8644可以阻断U50,488H对缺血心肌Cx43的保护性上调作用(P<0.01)。③在mRNA表达水平,Bay k8644亦可翻转U50,488H激活κ阿片受体后对缺血心肌Cx43mRNA的调控作用(P<0.01)。结论 U50,488H可通过抑制钙通道减少外钙内流,参与κ阿片受体对缺血心肌Cx43的稳定性调控及抗缺血性心律失常作用。     

三种阿片受体激动剂对突触传递的抑制作用

目的：比较不同浓度三种阿片受体激动剂对突触传递的抑制作用．方法：用细胞内记录和细胞外微电泳技术，于大鼠伏核脑片制备上记录神经元的兴奋性突触后电位和谷氨酸钠所致细胞膜去极化．结果：（ＤＡｌａ２，ＮＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙｏｌ）ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＤＡＧＯ），（ＤＰｅｎ２，５）ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＤＰＥＮ），ａｎｄｔｒａｎｓ（±）３，４ｄｉｃｈｌｏｒｏＮｍｅｔｈｙｌＮ［２（１ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］ｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（Ｕ５０４８８Ｈ）（１μｍｏｌ·Ｌ－１）均降低突触传递，尤以ＤＡＧＯ抑制作用最著．结论：三种阿片受体激动剂对突触传递的抑制作用均具有浓度依赖性，其作用机制与谷氨酸介导的突触传递受抑制有关．     

丹参对缺氧/复氧心肌的保护作用涉及百日咳毒素敏感的G蛋白

目的　研究丹参注射液对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用及其机制。方法　采用酶解分离成年大鼠心室肌细胞化学缺氧模型,用视频跟踪计算机系统、细胞内双波长钙荧光系统和光学法分别观察心肌细胞收缩力学、细胞内钙和乳酸脱氢酶(LDH)释放等指标。结果　丹参(3g/L)处理后降低心肌细胞最大收缩和舒张速率、收缩幅度以及电刺激诱导的钙瞬态幅度。缺氧导致细胞收缩力和钙瞬态幅度降低、舒张末细胞长度缩短、舒张末钙水平增高,复氧后各指标有所回复。缺氧/复氧引起LDH释放增多。用3g/L的丹参处理后,缺氧/复氧引起的心肌细胞最大收缩和舒张速率、收缩幅度和电刺激诱导的钙瞬态幅度高于单纯缺氧组,舒张末钙水平低于单纯缺氧组,LDH释放减少。预先用百日咳毒素处理,丹参引起的心肌保护作用被减弱。结论　丹参可能通过百日咳毒素敏感的G蛋白发挥对缺氧/复氧损伤心肌的保护作用     

丹参对缺氧/复氧心肌的保护作用涉及百日咳毒素敏感的G蛋白

目的研究丹参注射液对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用及其机制.方法采用酶解分离成年大鼠心室肌细胞化学缺氧模型,用视频跟踪计算机系统、细胞内双波长钙荧光系统和光学法分别观察心肌细胞收缩力学、细胞内钙和乳酸脱氢酶(LDH)释放等指标.结果丹参(3g/L)处理后降低心肌细胞最大收缩和舒张速率、收缩幅度以及电刺激诱导的钙瞬态幅度.缺氧导致细胞收缩力和钙瞬态幅度降低、舒张末细胞长度缩短、舒张末钙水平增高,复氧后各指标有所回复.缺氧/复氧引起LDH释放增多.用3g/L的丹参处理后,缺氧/复氧引起的心肌细胞最大收缩和舒张速率、收缩幅度和电刺激诱导的钙瞬态幅度高于单纯缺氧组,舒张末钙水平低于单纯缺氧组,LDH释放减少.预先用百日咳毒素处理,丹参引起的心肌保护作用被减弱.结论丹参可能通过百日咳毒素敏感的G蛋白发挥对缺氧/复氧损伤心肌的保护作用.     

к阿片受体可通过抑制β肾上腺素受体进而调节心肌细胞Cx43发挥抗缺血/再灌注性心律失常

目的观察κ阿片受体选择性激动剂(U50488H)及β肾上腺素受体激动剂(异丙肾上腺素,ISO)对大鼠心脏缺血/再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)引起的心律失常的影响,初步探讨U50488H对心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的调节机制。方法实验大鼠随机分为5组即对照组、I/R组、ISO+I/R组、U50488H+ISO+I/R组、Nor-BNI(κ阿片受体阻断剂)+U50488H+ISO+I/R组。观察每组心律失常的发生情况并计算心律失常评分,RT-PCR检测Cx43 mRNA表达及用免疫组化方法显示大鼠心肌Cx43的分布特征,半定量统计分析。结果①心律失常评分:ISO+I/R组高于I/R组(P<0.05),在ISO前给予U50488H则可以降低ISO引起的心律失常(P<0.05),其效应可被Nor-BNI阻断。②Cx43 mRNA水平:ISO+I/R组比I/R组略增高,在ISO前给予U50488H则可使基因表达水平降低(P<0.05),其效应可被Nor-BNI阻断。③Cx43蛋白表达:ISO+I/R组Total-Cx43高于I/R组(P<0.05),P-Cx43降低但与I/R组比较差异无统计学意义,给予U50488H后,可提高总Cx43和P-Cx43表达量(P<0.05),其效应可被Nor-BNI阻断。结论κ阿片受体激动剂可通过抑制β肾上腺素受体对Cx43调节从而发挥抗缺血/再灌注性心律失常的作用。     

抗百日咳毒素单克隆抗体的纯化及应用研究

目的纯化抗百日咳毒素(PT)的单克隆抗体(M cAb),并建立特异、准确的PT定量检测方法。方法采用辛酸-硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析法纯化杂交瘤细胞腹水,并经阻断抑制试验筛选识别不同表位的M cAb,用于建立定量检测PT的ELISA方法。结果经SDS-PAGE分析,纯化M cAb的纯度均在90%以上,选择二株识别不同抗原位点M cAbs,应用于检测PT的双抗夹心ELISA方法,灵敏度为2.14μg/L,批内变异系数5.85%,批间变异系数9.27%,平均回收率为108.12%,应用该法测定了国内几大生产厂家送检的无细胞百日咳疫苗原液中PT含量。结论获得了纯度高的抗PT M cAb,建立了一种特异、准确的定量检测PT的ELISA方法,并用于无细胞百日咳疫苗原液中PT含量的检测,为无细胞百日咳疫苗的质量控制提供了有力的手段。     

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的  建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussis toxin, PT）含量的测定方法。方法  免疫家兔制备高效价抗PT血清,纯化抗PT多克隆抗体并进行酶标记,建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果  建立的方法在0~20 ng/ml PT测量区间呈现最佳线性,相关系数＞0.99,且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素,结果均为阴性,说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验间3次测定16.0、8.0、4.0、3.0 ng/ml PT,变异系数为2.8%~9.7%,回收率为95.7%~106.0%,精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求,定量限度为3.0 ng/ml。结论  该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的PT,为PT质量控制奠定了重要基础。     

κ阿片受体激动剂U50488H对大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的影响及作用机制

目的:研究选择性κ阿片受体激动剂U50488H对大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的影响及作用机制。方法:建立心肌缺血再灌注损伤动物模型,将实验大鼠按随机原则分组,监测大鼠心率(HR)、动脉压(ABP)、左心室内压(LVP)及收缩(+dp/dtmax)和舒张功能(-dp/dtmax)等血流动力学指标,观察大鼠室性心律失常的发生情况和作用机制。结果:U50488H可显著降低大鼠HR、ABP、LVP及±dp/dtmax。在心肌缺血前预先给予U50488H,可明显降低大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的发生率以及室性心律失常评分,该作用可被选择性к阿片受体阻断剂Nor-BNI阻断。提前给予Gi/o蛋白抑制剂pertussis toxin、NO合成酶抑制剂L-NAME、KATP通道阻断剂glibenclamide和PKC的选择性抑制剂chelerythrine,结果发现U50488H的抗心律失常作用减弱(P<0.01);而提前给予TK的抑制剂genistein,对U50488H的抗心律失常作用则无明显影响(P>0.05)。结论:U50488H可通过激动心脏к阿片受体减少大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的发生。在激活к阿片受体前,分别预先阻断Gi/o蛋白P、KC以及KATP通道,可以使к阿片受体介导的抗心律失常的作用减弱或消失,提示к阿片受体的信号转导途径可能涉及Gi/o蛋白P、KC和KATP通道。     

百日咳杆菌毒素S1亚单位突变体的研究进展

百日咳杆菌毒素(PT)是目前无细胞百日咳疫苗中的主要保护性成分,其中PT的S1亚单位又是其主要的功能性亚基,具有免疫保护活性和多种毒性。在对多个S1突变体的生物学及免疫学研究后发现,其中的一个S1的双位点突变体(PTX-9K/129G)在保持有良好的免疫原性和免疫保护作用的基础上,大大降低了PT的毒性,有望成为理想的百日咳疫苗候补抗原。     

κ-阿片受体激动对异丙肾上腺素诱导的乳大鼠心肌细胞肥厚的抑制作用

目的通过观察选择性κ-阿片受体(κ-OR)激动剂U50488H抑制异丙肾上腺素(Iso)诱导乳大鼠心肌细胞肥厚的作用及其对细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)瞬变及钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的影响,研究κ-OR激动抑制Iso诱导的大鼠心肌细胞肥厚的信号传导机制。方法以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型,应用β肾上腺素受体激动剂Iso10μmol.L-1诱导心肌肥大,观察U50488H1μmo.lL-1的作用,并进一步探讨在CaMKⅡ特异性抑制剂KN930.2μmol.L-1,普萘洛尔2μmol.L-1及L-钙通道阻滞剂维拉帕米1μmol.L-1存在情况下,κ-OR的激活对心肌肥厚的作用。用Lowry法检测心肌细胞蛋白含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;[3H]亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白的合成;采用Till阳离子测定系统,以Fura-2/AM为荧光探针,观察心肌细胞[Ca2+]i瞬间变化;用Western蛋白印迹法测定CaMKⅡδB表达。结果Iso10μmol.L-1使心肌细胞总蛋白含量、体积和蛋白合成明显增加,U50488H1μmol.L-1抑制Iso诱导的心肌肥大,且抑制程度与KN930.2μmol.L-1,普萘洛尔2μmol.L-1及维拉帕米1μmol.L-1相似,在KN93存在的情况下,U50488H抑制Iso诱导的心肌肥大作用增强;U50488H能降低Iso引起的心肌细胞[Ca2+]i瞬间变化升高;Iso能明显增强心肌细胞内CaMKⅡδB的表达,U50488H能降低其表达。结论κ-OR激动剂U50488H可能通过降低心肌细胞[Ca2+]i瞬间变化和减少心肌细胞内CaMKⅡδB的表达,抑制Iso诱导的乳大鼠心肌细胞肥厚。     

应用中国仓鼠卵巢细胞法检测百日咳毒素毒性方法的建立及初步验证

目的  建立用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞检测百日咳毒素（PT）毒性的方法,并对其适用性进行初步验证。方法  根据PT能特异地使CHO细胞簇集的特性,以国家PT标准品为参考品,取多批脱毒后PT进行检测,摸索适宜的孵育时间、细胞悬液浓度等实验条件,建立PT毒性的体外检测方法。对PT参考品进行倍比系列稀释,确定本法的检测限。对5批脱毒后PT进行重复检测,验证本法的重复性。结果  利用不同浓度CHO细胞对脱毒PT进行测定,确定最佳细胞浓度为5×104/ml,并通过最佳浓度细胞确定簇集结果的最佳判定时间为PT接种后48 h。本法对PT标准品的检测限定为125~500 pg/ml。用本法重复测定5批脱毒PT的残余毒性,变异系数为0.0%~34.6%,说明该法重复性良好。结论  建立的CHO细胞检测法快捷、简便,能灵敏、准确地检测脱毒PT的残余毒性,可用于相关疫苗产品的质量控制。     

检测百日咳毒素活性的中国仓鼠卵巢细胞簇集法的建立和初步应用

目的  建立检测百日咳毒素（pertussis toxin,PT）活性的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞簇集法,并将建立的方法应用于无细胞百日咳疫苗生产的质量控制。方法  将PT标准品系列稀释后与培养的CHO细胞混合,观察PT引起CHO细胞簇集的敏感度,并研究反应时间、反应溶液的pH值、缓冲液浓度、加样顺序等因素对PT引起CHO细胞簇集的影响。应用建立的方法检测百日咳疫苗生产过程中脱毒前后的PT活性及丝状血凝素和百日咳黏着素组分中残留的PT活性。    结果  PT使CHO细胞发生最佳簇集的理想反应时间是24 h,最适pH值是7~8,适宜氯化钠缓冲液浓度为0.15 mol/L,最优加样顺序是先加CHO细胞再加PT。建立的CHO细胞簇集法的检测敏感度为10 pg/ml PT,且重复性良好。结论  CHO细胞簇集法可用于PT活性检测。     

编码百日咳毒素S1亚单位的DNA疫苗诱导的抗百日咳杆菌的保护作用[英]／Kamachi K，Konda T，Arakawa Y／／Vaccine.

百日咳毒素(PT)是百日咳杆菌的主要致病因子，由5个亚单位组成，S1亚单位具有酶活性，而S2～S5亚单位参与靶细胞的结合。研究发现抗S1亚单位的单克隆抗体可以预防百日咳杆菌感染，源自S1亚单位的重组蛋白和合成肽能诱导机体产生抗PT的保护性免疫应答，提示S1亚单位能用于百日咳疫苗的研制。     

κ阿片受体激动剂U50488H对血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞产生白介素-6和白介素-8的影响

目的探讨κ阿片受体在血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞产生白介素-6和白介素-8中的作用。方法整体实验观察大鼠静脉注射U50488H(1.5 mg.kg-1)后血中AngⅡ水平的变化;体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+U50488H组,AngⅡ+U50488H+nor-BNI(κ阿片受体阻断剂)组。分别用磷酸盐缓冲溶液、AngⅡ(10-9~10-5mol.L-1)或提前给予κ阿片受体激动剂或(和)阻断剂诱导0~24 h,收集0、3、6、12、24 h等时间点的细胞培养液,采用酶联免疫吸附法分别检测细胞培养液IL-6和IL-8水平。结果静脉注射U50488H可明显降低血中AngⅡ的水平,该作用可被nor-BNI(2 mg.kg-1)所阻断。AngⅡ可浓度和时间依赖性诱导内皮细胞产生释放IL-6和IL-8,提前给予U50488H(10-5mol.L-1)可明显抑制AngⅡ诱导内皮细胞产生释放IL-6和IL-8。而nor-BNI(10-5mol.L-1)本身没有任何作用但可完全阻断U50488H的上述作用。结论 U50488H可通过下调AngⅡ水平和抑制AngⅡ的作用来减少内皮细胞产生IL-6和IL-8,表明κ阿片受体可能在抗炎中具有一定调节作用。