恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫鼠体内抗原定位研究

目的：用恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫小鼠，观察其在宿主体内各组织的抗原分布情况。方法：提取目的基因PfCSP在HeLa细胞中的表达产物，免疫注射BALB／c小鼠。取免疫后4周及7周小鼠心脏、肝脏、脑、脾及肌肉，通过免疫酶组织化学法及间接免疫荧光法检测组织内的抗原。结果：免疫7周后的BALB／c小鼠肝脏组织枯否氏细胞内及肝细胞膜上可见棕黄色特异性抗原－抗体反应，而免疫鼠心、脑、肌肉未出现明显的阳性反应。结论：恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达蛋白能被肝实质细胞特异性识别，其免疫后的抗原分布主要在肝脏。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株DNA疫苗 在小鼠体内的免疫反应

:【目的】探讨恶性疟原虫DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应。【方法】将恶性疟原虫FCC 1/HN株重组质粒pcDNA3 Pfs2 5及 pcDNA3 EBA175 /HRPⅡ经骨骼肌途径分别单独注射或两者混合注射免疫BALB/c小鼠 ,观察免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4 /CD8 T细胞亚群比值和NK细胞杀伤活性的变化。【结果】pcD NA3 EBA175 /HRPⅡ与 pcDNA3 Pfs2 5分别单独肌肉注射或两者混合肌肉注射免疫小鼠后 ,均可见血清IgG抗体滴度增高 ;针对恶性疟原虫抗原的特异性T淋巴细胞增殖反应增强 ;CD4 /CD8 T细胞比率下降以及NK细胞杀伤活性增强。【结论】提示肌肉注射为一有效的DNA疫苗免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫有性期阶段或无性红细胞阶段的重组质粒单独或两者混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫反应和NK细胞杀伤活性。     

恶性疟MSP-2、CSP多价DNA疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的：探讨恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-2(MPS-2)和环子孢子蛋白(CSP)组成的DNA多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法：将重组真核表达质粒pBK/CSP和pBK/MSP-2经骨骼肌注射BALB/c小鼠，小鼠经多价疫苗免疫8wk后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生；用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化。结果：与对照组相比，疫苗组CD^4 cd^8 淋巴细胞有显的增高，体外培养的脾脏细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时，免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应。结论：恶性疟原虫FCC-1/HN，pBK/MSP-2和pBK/CSP多价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2 DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 探讨疟原虫FCC-1／HN株泉殖子表面蛋白-2(MSP-2)DNA疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒PBK／MSP-2经骨骼肌注射BALB／c小鼠。小鼠经DNA疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生。结果 与对照组相比，疫苗组CD4^ CD8^ 淋巴细胞有显著性的增高，体外培养的脾脏细胞IFN-γ有高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC-1／HN MSP-2 DNA疫苗诱导了一个TH1的免疫疫答类型。     

虫库FCC_1/HN恶性疟原虫分离株某些生物活性鉴定

为了便于进行疟疾疫苗保护性观察及建立恶性疟原虫克隆株的需要,对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株进行某些生物特性鉴定。通过体外培养条件变更以观察现存FCC1/HN分离株恶性疟原虫的生长特性,以体外微量法测定该株原虫对氯喹的敏感性及用套式PCR/RFLP分析方法对该株原虫二氢叶酸还原酶基因型进行鉴定。结果显示,现存FCC1/HN株恶性疟原虫对体外培养条件适应性强,对氯喹高度敏感,DHFR基因的第108号编码为AAC突变型。建议对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株的生物活性定期进行鉴定。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3＇端的克隆及序列分析

[目的]克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)肝期抗原1基因(LSA-1)3＇端序列,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA-13’端序列的差异.[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA-13’端序列,用T-A克隆法将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA-13’端序列的同源性分析.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN LSA-13’端序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-LSA-1重组质粒.测序表明,所克隆的LSA-1 3 ＇端大小为795bp,编码264个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF4、T9/96、KEN、PNG及BRA株LSA-13’端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同.[结论]克隆了恶性疟原虫FCC1/HN LSA-13’端片段.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HNLSA-1 3＇端序列与其它分离株有高度的同源性.     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫体外短期无血清培养上清可溶性抗原的纯化和分析

本实验对恶性疟原虫(FCC—1/HN)裂殖体体外短期无血清培养上清可溶性抗原进行了纯化,并用CIE及ELISA法检测和分析上清可溶性抗原的免疫学活性.结果表明,恶性疟原虫体外短期无血清培养上清中有可溶性抗原存在,抗原特异性与恶性疟原虫虫体抗原相似:经亲和层析纯化的上清抗原中不含可测水平的红细胞膜抗原成分.     

ISA720与CpG联合佐剂增强恶性疟原虫抗原的免疫原性

目的评价CpG佐剂对以PfCP-2．9f/ISA720佐剂为基础的联合疟疾抗原的免疫原性。方法使用ISA720及ISA720＋CpG佐剂与恶性疟原虫抗原制备制剂,免疫BALB／c小鼠,考察不同佐剂增强免疫的效果。通过检测免疫血清中特异性IgG的水平、识别天然抗原的能力、分析特异性IgG的亚类分布等指标进行评价。结果CpG佐剂显著提升了联合疟疾抗原在BALB／c小鼠中产生特异性抗体的量（P〈0．01）,免疫血清能有效识别红内期疟原虫天然抗原,IFA滴度显著提高（P〈0．01）,IgG亚类分析显示该佐剂能有效刺激小鼠产生针对PfCP-2．9和Pfclet-3的多种IgG亚类抗体。结论CpG显著提高了联合疟疾抗原的免疫原性。     

BCG载体携带恶性疟MSP-1和MSP-2基因免疫小鼠实验研究

目的研究恶性疟原虫FCC-1／HN株裂殖子表面蛋白-1（MSP-1）和表面蛋白-2（MSP-2）与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法将重组pBCG／MSP-1和pBCG／MSP-1—2多价疫苗经皮下注射BALB／c小鼠，经多价疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生；用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化，体外测定了抗体介导的抑制实验。结果与对照组相比，疫苗组CD^4＋和CD^8＋T淋巴细胞有显著性增高，体外培养的牌细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时，免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应，抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论恶性疟原虫FCC-1／HN pBCG／MSP-1和pBCG／MSP-2价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性

目的:探讨恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠(BALB/ca、C57BL/6J、C3H/He、DBA/2J及昆明种)中的免疫原性和免疫反应特性.方法:以ISA720为佐剂,PfCP-2.9抗原皮下免疫5种品系小鼠3次,间隔3周.以ELISA检测免疫血清中特异性抗体的动态变化、IgG抗体亚型及对融合抗原各组分的抗体水平,以间接荧光抗体实验分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况.结果:5种品系小鼠均能产生针对PfCP-2.9的免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达105以上.PfCP-2.9所诱生的免疫血清不但能识别MSP1-19和AMA-1(Ⅲ)两个主要片段,而且能识别恶性疟原虫天然抗原.所诱导的4种IgG抗体亚型中,IgG1和IgG2a是免疫血清中主要的抗体类型.但特异性抗体水平及抗体亚型分布因遗传背景不同而异.结论:融合蛋白PfCP-2.9在5种不同品系小鼠中具有强的免疫原性,其抗体能识别疟原虫天然蛋白.     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫红内期p41-3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

[目的]构建恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3;测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异.[方法]根据p41-3基因已知序列设计合成2对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆.以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcD-NA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定.测序表明,FCC1/HN株p41-3基因大小为2 137 bp,编码375个氨基酸.恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98.98%,编码氨基酸序列同源性为99.73%.[结论]从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1/HN株p41-3基因的序列;FCC1/HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性.     

恶性疟原虫海南株节结相关组氨酸富集蛋白基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）节结相关组氨酸富集蛋白（KAHRP）基因，并进行序列分析。方法 采用PCR技术分两段从FCC1／HN株基因组A趸扩增出部分序列重叠的KAHRP基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这2个片段的序列，从而得到全长KAHRP基因序列。应用AnthProt、DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 恶性疟原虫FC1/HN KAHRP全基因长2358个核苷酸，在112至564位核苷酸是内含子，全基因编码634个氨基酸残基，其中赖氨酸含量为14．35％，丙氨酸含量为9．15％，组氨酸含量为7．72％；分子量为69．37kDa。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、FCR3、India-1、India-2、NF17、Palo-alto,PUPSP株KAHRP基因编码的氨基酸残残留基有52个氨基酸残基替代位点，并存在氨基酸残基序列的增加和缺失。经多参数综合分析，可能有5个潜在的抗原表位区。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株KAHRP基因。序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株KAHRP基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的 构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应.方法 从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S.将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达.结果 小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答.此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达.结论 乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。