2001年研究生毕业论文摘要

阿霉素单用及联用维拉帕米对 OS732细胞毒性作用的机制硕士研究生　陈　鹏专　　　业　外科学 (骨科学 )导　　　师　林建华教授　　目的　探讨阿霉素对 OS732细胞的毒性作用 ,维拉帕米是否对阿霉素有增效作用及其作用机制。　方法　用MTT法检测肿瘤细胞存活率 ,比较单用阿霉素及联用维拉帕米对 OS732细胞的毒性作用 ;以流式细胞仪方法检测阿霉素及联用维拉帕米诱导后不同时间点 OS732细胞多药耐药指标 (Pgp、Topo 和 GSTπ)表达情况 ;以琼脂凝胶电泳法观察阿霉素单用及联用维拉帕米诱导后不同时间点 OS732细胞抽取 DNA的电泳图 ;…     

阿霉素单用及联用维拉帕米对OS732细胞毒性作用的机制

目的 探讨阿霉素对OS732细胞的毒性作用，维拉帕米是否对阿霉素有增效作用及其作用机制。方法 用MTT法检测肿瘤细胞存活率，比较单用阿霉素及联用维拉帕米对OS732细胞的毒性作用；以流式细胞仪方法检测阿霉素及联用维拉帕米诱导后不同时间点OS732细胞多药耐药指标（Pgp,TopoⅡ和GSTπ）表达情况；以琼脂凝胶电泳法观察阿霉素单用及联用维拉帕米诱导后不同时间点OS732细胞抽取DNA的电泳图；流式细胞仪方法检测阿霉素及联用维拉帕米诱导后OS732细胞凋亡相关因子CD95及Bax蛋白的表达情况。结果 （1）随阿霉素的浓度递增，OS732细胞的存活率呈下降趋势，即阿霉素对OS732细胞生长抑制率呈浓度相关性。同剂量阿霉素对OS732细胞随作用时间延长，细胞存活率下降，但这种趋势并不随时间延长而等幅递增。维拉帕米增强阿霉素对OS732细胞的毒性作用。（2）阿霉素可使OS732细胞获得性耐药，且这种获得性耐药与Pgp,TopoⅡ和GSTπ有关。Pgp和GSTπ表达存在相关性。阿霉素诱导后OS732细胞Pgp和GSTπ表达随时间延长而上调。维拉帕米延缓乃至下调了Pgp的表达。而对TopoⅡ及GSTπ无类似作用。（3）促进肿瘤细胞亡是阿霉素的抑瘤机制之一，且与Fas介导的细胞凋亡途径有关。与Bax途径无关。阿霉素诱导的OS732细胞凋亡呈时间依赖性。维拉帕米可促进阿霉素诱导的OS732细胞凋亡。结论 维拉帕米使阿霉素对OS732细胞的毒性作用增强。临床上应用阿霉素化疗时，更宜选用持续性静脉滴注给药，且以维持48h为宜。阿霉素作用后，OS732细胞获得性耐药与Pagp,TopoⅡ和GST－π有关。阿霉素对OS732细胞毒性作用与它能促进细胞凋亡有关，而维拉帕米延缓Pgp介导的多药耐药的同时促进阿霉素诱导的细胞凋亡。因此，通过促进肿瘤细胞凋亡来实现肿瘤化疗多药耐药的逆转是一条有效途径，本研究为进一步进行肿瘤分子这治疗的研究提供实验基础。     

5aza2dc联合化疗药物诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨氮杂脱氧胞苷(5aza2dc)联合化疗药物对骨肉瘤疗效的影响。方法:5aza2dc、阿霉素(DOX)及两药联用处理人骨肉瘤OS732细胞24h和48h,MTT法测试细胞毒性,倒置相差显微镜、透射电镜下形态学观察。结果:0.2μmol/L的5aza2dc与1PPC的DOX联合应用24h后,肿瘤抑制率明显高于单用药组(P<0.01)。联用48h见大量细胞脱落悬浮于培养液中。电镜观察可见核固缩、核染色质边集及凋亡小体。结论:骨肉瘤OS732细胞对5aza2dc不敏感。DOX增强OS732细胞对5aza2dc的敏感性。     

康莱特联合顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞

目的 研究康莱特联合顺铂对骨肉瘤细胞的杀伤作用及其相关机制，探寻骨肉瘤的中西医结合化疗方案。方法 免疫组化及RT—PCR方法检测不同浓度康莱特作用下骨肉瘤OS732细胞的Fas表达，并将康莱特与顺铂单独及联合应用于OS732细胞，采用MTT法检测细胞毒性作用，流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例，相差显微镜及荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变。结果 康莱特可上调OS732细胞的Fas表达并诱导凋亡，10μL／mL康莱特与1μg／mL顺铂合用于OS732细胞的抑制率与各自单用时相比明显提升（P〈0．01）。细胞形态观察及凋亡率测定也显示，康莱特与顺铂联用可诱导更多OS732细胞凋亡。结论 康莱特可协同顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞，这可能与康莱特上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡有关。     

片仔癀对人骨肉瘤细胞U2OS细胞周期的影响

目的:探讨片仔癀对体外培养的人骨肉瘤U2OS细胞周期的作用及机制.方法:0.8、1.2、1.6mg/ml片仔癀干预U2OS细胞24、48、72h后,MTT检测片仔癀对U2OS细胞的生长抑制作用;片仔癀干预U2OS细胞48h后流式细胞术分析细胞周期的变化;Western blot检测Survivin蛋白的表达.结果:与对照组比较,不同浓度的片仔癀作用24、48、72h后,不同程度的抑制了U2OS细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性(P＜0.05);片仔癀干预U2OS细胞48h后细胞发生G2/M阻滞,Survivin蛋白表达较对照组明显降低(P＜0.05).结论:片仔癀可抑制骨肉瘤U2OS细胞的生长,诱导U2OS细胞发生G2/M周期阻滞,周期阻滞的发生与Survivin蛋白表达减少有关.     

参麦注射液对人成骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732逆转作用

目的选用人成骨内瘤多药耐药细胞株R-OS-732为对象来观察参麦注射液逆转多药耐药（MDR）的作用。方法用MTY法检测常用化疗药物对R-OS-732的毒性。结果经MTY法发现参麦注射液能增加R-OS-732对阿霉素的敏感性，使阿霉素半数抑制浓度（IC50）由12．4ms／L，降至7．21mg／L，部分逆转了R-OS-732对阿霉素耐药性，逆转倍数为1．72倍。同时，参麦注射液可提高R-OS-732细胞内化疗药物的浓度，增加化疗药的毒性作用。结论参麦注射液能逆转人成骨内瘤多药耐药细胞株R-OS-732，其机制可能与胞内阿霉素浓度有关。     

重组人白细胞介素-2对人胃癌细胞SGC7901/ADR多药耐药性的逆转研究

目的 本实验以阿霉素（adriamgcin,ADM）诱导的人胃癌SGC7901/ADR多药耐药细胞为对象,初步探讨IL-2对耐药性的逆转作用及其可能的机制.方法 采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定IL-2对敏感细胞SGC7901和耐药细胞SGC7901/ADR的非细胞毒性药物剂量;以非细胞毒性药物剂量的IL-2处理细胞,分别于0h,24h,48h后加入不同浓度的阿霉素,采用MTT法检测ADM对细胞的半数抑制浓度（IC50）,分析IL-2对两种细胞ADM敏感性的影响;运用流式细胞仪检测IL-2对SGC7901/ADR细胞内ADM浓度、细胞周期和细胞凋亡的影响;采用免疫细胞化学染色法检测IL-2作用前及作用后24h,48h耐药细胞P-糖蛋白（P-gp）的表达.结果 IL-2作用24h后及作用48h后均对耐药性有明显逆转（P〈0.01）,且具有时间依赖性;加入IL-2后细胞凋亡率均比加药前增加（P〈0.05）,但不同时间无显著性差异（P〉0.05）;IL-2作用24h和48h后P-gp表达分别降低为37.4和36.0（P〈0.01）,但两组间无显著性差异（P＞0.05）.结论 IL-2可抑制SGC7901/ADR细胞的增殖,促进细胞凋亡,细胞对ADM的敏感性增加,耐药性部分逆转,且具有时间依赖性和剂量依赖性;其机制主要是降低P-gp表达,且可促进细胞凋亡,有助于耐药性的逆转.     

游离脂肪酸对βTC6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响及吡格列酮的干预作用

目的：观察游离脂肪酸（FFA）对体外培养的βTC6细胞胰岛素分泌功能的影响及盐酸吡格列酮作用的干预。方法：体外培养βTC6细胞,0.5mmol/LFFA分别干预1h、48h,放射免疫法检测胰岛素。不同浓度的吡格列酮（0.1、1.0、10.0μmol/L）与FFA共同干预βTC6细胞48h,放射免疫法检测胰岛素浓度。结果：FFA干预1h后,βTC6细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）增加（P〈0.05）,FFA干预48h后,βTC6细胞的GSIS较干预前下降（P〈0.05）。FFA与吡格列酮共同干预时,随着吡格列酮浓度的升高,GSIS呈上升的趋势,1.0μmol/L和10.0μmol/吡格列酮与FFA共同干预组GSIS较FFA干预48h增加（P〈0.05）。结论：FFA对B细胞具有短期刺激作用及脂毒性作用,吡格列酮可以部分改善脂毒性作用。     

乳腺癌耐药性与MAPK信号转导关系的研究

目的探讨乳腺癌细胞阿霉素耐药性与p38MAPK通路的关系。方法用流式细胞术检测SB203580(15μmol/L)干预后细胞的凋亡、细胞内阿霉素浓度的改变、细胞对阿霉素敏感性。结果经SB203580(15μmol/L)干预24h和48h后,流式细胞仪检测见MCF-7/Adr细胞发生显著凋亡,凋亡率分别为25.36±1.17%和38.21±1.25%,并呈一定时间依赖性(P<0.05);显著高于空白对照组及DMSO组MCF-7/Adr细胞的0.65±0.21%和0.81±0.16%(P<0.01);细胞内阿霉素浓度亦显著增加,平均荧光强度分别为32.45±2.36及41.66±3.12,均显著高于空白对照组及DMSO组的14.17±1.45及16.28±0.63(P<0.01);另外,SB203580干预48h使MCF-7/Adr细胞内阿霉素浓度增加的作用强于24h组,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。结论提示p38MAPK通路与乳腺癌细胞阿霉素耐药密切相关。     

R-型维拉帕米逆转肿瘤细胞多药耐药的实验研究

目的 :检测 R-型维拉帕米 (R- Verapamil)体外逆转肿瘤细胞多药耐药的作用及动物毒性 ,探讨 R-型维拉帕米成为未来化疗增敏剂的可能性。　方法 :细胞毒性的测定用 MTT法 ,细胞内阿霉素积蓄的测定用荧光分光光度法。动物毒性试验用 BAL B/ c小鼠腹腔注射法。　结果 :1 .2 5 μm ol/ L 的 R-型维拉帕米即可显著增加耐药 KBv2 0 0细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性 (P<0 .0 1 ) ,其效应与作用浓度有关。在增敏和增加细胞内阿霉素积蓄方面 ,R-型维拉帕米与混旋维拉帕米效果一样 ,但 R-型维拉帕米的动物毒性低于混旋维拉帕米。　结论 :1 .2 5 μm ol/ L 的R-型维拉帕米能部分逆转耐药 KBv2 0 0细胞的多药耐药性。此浓度能被人体所接受。R-型维拉帕米有望成为未来的化疗增敏剂     

“钾异心”停搏液对缺血心肌电活动的影响

观察“钾异心”停搏液对缺血心肌的保护作用并与高钾停搏液比较。用无糖不充氧台氏液浸浴离体豚鼠右心室乳头肌３ｈ造成缺血损伤，以心肌细胞电生理参数为指标。缺血后心肌电生理参数下降，其中以“钾异心”组下降最快速彻底，复灌后只有“钾异心”组电生理各参数都恢复正常。结论“钾异心”停搏液可快速彻底抑制心肌电活动有效保护缺血心肌。     

人转铁蛋白-甲氨喋呤结合物对人肝细胞、人肝癌细胞体外细胞毒的作用特点

目的 了解人转铁蛋白（Tf）与甲氨喋呤（MTX）结合物（Tf-MTX)对人肝细胞和人肝癌细胞体外细胞毒的特点。方法 采用氧化葡聚糖（Dex)T－40作为中介,联结Tf与MTX制备人转铁蛋白－甲氨喋呤结合物（Tf-MTX),用四甲偶氮唑蓝法与比较结合物对人肝细胞L－02及人肝癌细胞Bel7404的体外杀伤强度。结果 体外细胞毒试验显示,Tf－MTX对人肝细胞L－02作用48h的TC50是对人肝癌细胞Bel7404的3．36倍,而TX对上述细胞作用1h的IC50是Tf-MTX的3．22倍。结论 Tf-MTX对肿瘤 细胞Bel7404的杀伤作用有选择性。     

静脉注射蕲蛇酶对大鼠血浆t—PA和PAI—1活性的影响

探讨蕲蛇酶溶栓作用机制。方法应用发色底物（Ｓ２３９０）显色法测定大鼠静脉注射蕲蛇酶２和４Ｕ／ｋｇ（３００和６００μｇ／ｋｇ）后５，１５，２５和４５ｍｉｎ血浆中组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）和纤溶酶原激活剂抑制物（ＰＡＩ－１）的活性。结果正常大鼠静脉注射蕲蛇酶后５ｍｉｎ血浆中ｔ－ＰＡ活性即开始升高，１５ｍｉｎ时达到高峰，低和高剂量组ｔ－ＰＡ活性（ＩＵ／ｍｌ）分别由给药前１６１．８１±２８．７８和１８９．１４±７１．３０升至３８９．５６±１４３．１０和４８２．８７±８５．６７，随后活性下降，至４５ｍｉｎ时基本恢复正常。与此同时，ＰＡＩ－１的活性变化不明显。结论蕲蛇酶溶栓作用与其促进ｔ－ＰＡ释放有关。     

反义脱氧寡核苷酸诱导HL-60细胞分化及对c-myc基因表达的影响

目的 研究二个针对c-myc基因的反义脱氧寡核苷酸（简称反义核酸）对急性白血病细胞HL－60的分化及基因表达的作用。方法 以人工合成二个硫代寡核苷酸作用于HL－60细胞后,采用流式细胞仪检测c-myc蛋白表达和HL－60细胞分化抗原,RT－PCR方法检测c-myc基因表达,并在光镜下观察以瑞特染色及NBT染色的HL－60细胞形态。结果 经反义核酸作用后,c-myc蛋白的表达有明显下降,与作用浓度与时间相关。急性白血病HL－60细胞出现中,晚幼粒细胞增多,出现CD15增高,HLA－DR及CD34降低是细胞分化的表现。同时RT－PCR分析c-myc基因扩增明显减少。结论 反义核酸对急性白血病细胞HL－60的诱导分化的同时抑制c-myc基因表达。     

变异型CD44在胃腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨胃腺癌组织中变异型ＣＤ４４（ＣＤ４４ｖ）的表达及其与淋巴结转移和预后的关系。②方法应用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶（Ｓ－Ｐ）免疫组织化学技术,对１０５例胃腺癌ＣＤ４４ｖ６的表达进行了检测。③结果ＣＤ４４ｖ６蛋白的阳性表达率为４８．６％,ＣＤ４４ｖ６在胃腺癌的表达与肿瘤分化、浸润深度、临床分期和预后均有关系（χ２＝４．４１～８．９７,Ｐ均＜０．０５）,与淋巴结转移关系密切（χ２＝９．２３,Ｐ＜０．０１）。④结论ＣＤ４４ｖ６表达是判断胃腺癌淋巴结转移及病人预后有价值的指标之一。     

肿瘤坏死因子辅佐骨肉瘤化疗的体外研究

目的：探讨肿瘤坏死因子（ Ｔ Ｎ Ｆ）及其与阿霉素（ Ａ Ｄ Ｍ ）共同作用对骨肉瘤 Ｏ Ｓ ７３２及耐药模型 Ｒ Ｏ Ｓ ７３２细胞活性的影响。方法：应用阿霉素诱导建立 Ｒ Ｏ Ｓ ７３２,用 Ｍ Ｔ Ｔ 法测定 Ｔ Ｎ Ｆ 及其与 Ａ Ｄ Ｍ 共同作用下 Ｏ Ｓ ７３２及 Ｒ Ｏ Ｓ ７３２细胞的存活率（ Ｃ Ｓ Ｒ）。结果： Ｒ Ｏ Ｓ ７３２细胞表现出明显耐药,对 Ａ Ｄ Ｍ 耐药倍数达３０以上,且耐药表型 Ｐ １７０蛋白、 Ｇ Ｓ Ｔ、 Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ Ⅱ呈强阳性表达。 Ｔ Ｈ Ｆ 单独作用,无论是 Ｏ Ｓ ７３２还是 Ｒ Ｏ Ｓ ７３２细胞,在１００ ｋ Ｕ／ｍ ｌ内 Ｃ Ｓ Ｒ 均在１００％ , Ｔ Ｎ Ｆ 与 Ａ Ｄ Ｍ 共同作用后的 Ｃ Ｓ Ｒ 明显低于 Ａ Ｄ Ｍ 单独作用组,在 Ｒ Ｏ Ｓ ７３２细胞更明显（ Ｐ＜ ０００５）。结论：单独应用 Ｔ Ｎ Ｆ在１００ ｋ Ｕ／ｍ ｌ内对骨肉瘤细胞活性无影响,而与 Ａ Ｄ Ｍ 联合应用则明显增加 Ａ Ｄ Ｍ 的抗肿瘤效应,在耐药细胞中表现更为明显。     

胰岛素对NIH3T3细胞生长和Ras-MAPK信号途径的影响

目的 探讨胰岛素激活的Ras-MAPK信号途径对鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）生长的影响。方法 藉四唑蓝比色法（MTT法）和蛋白免疫印迹试验分别观察胰岛素对NIH3T3细胞生长和胞内丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）活性的影响。结果 胰岛素对NIH3T3细胞的促增殖作用呈时间和浓度依赖性，10mU/ml胰岛素对NIH3T3细胞的促增殖作用效果最佳，对NIH3T3细胞作用的EC50是0.2mU/ml(48h);0.14mU/ml(72h)。MAPK在10mU/ml胰岛素刺激1min后即出现酪氨酸磷酸化，10min达到高峰。胰岛素作用10min，MAPK酪氨酸磷酸化程度随浓度增高（0.1,1.0,10mU/ml)而递增。结论 胰岛素对NIH3T3细胞促增殖作用与激活Ras-MAPK信号途径相关。     

恶性肿瘤病人T淋巴细胞亚群和IL-2水平的变化

目的探讨恶性肿瘤病人外周血Ｔ淋巴细胞亚群和白细胞介素－２（ＩＬ－２）水平的变化。②方法采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（ＡＰＡＡＰ）法和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法,检测了６０例恶性肿瘤病人和６０例健康人Ｔ淋巴细胞亚群和ＩＬ－２水平的变化。③结果恶性肿瘤病人ＣＤ２,ＣＤ４,ＣＤ４／ＣＤ８和ＩＬ－２明显降低,而ＣＤ８明显增高,与对照组比较差异均有显著性（ｔ＝３．８２～１６．３９,Ｐ＜０．００１）。恶性肿瘤病人ＣＤ４／ＣＤ８与ＩＬ－２呈正相关（ｒ＝０．７６４,Ｐ＜０．００１）。④结论恶性肿瘤病人免疫功能明显异常。     

人外周血树突细胞的分离与提纯

目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞（ＤＣ）。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,培养２小时后,取会细胞,在无血清培养基中加入不同的细胞在子,于２的第１,６,８天对形态,表型和功能分擀行测定,并在光镜、电镜下观察ＤＣ的纯度与得率。结果 体外培养６～８天可获得高纯度大量的ＤＣ,较高表达ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８３和ＣＤ８６,能强烈激发同种慢体Ｔ淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血     

自制磷酸钙骨水泥的生物相容性和安全性

目的　研究自制磷酸钙骨水泥 (CPC)的生物相容性和安全性 ,为临床应用提供实验依据。　方法　采用浸提法制备自制磷酸钙骨水泥生理盐水和培养液浸提液 ;采用 MTT法进行细胞毒性试验 ;应用平板掺入法进行Ames试验 ;在小鼠腹腔内注射 CPC浸提液 ,取胸骨髓制片行微核试验 ;采用分光光度法进行溶血试验 ;通过新西兰兔骶棘肌及股骨髁内植入法行植入试验。　结果　自制 CPC的细胞毒性为 级 ;对健康人血的溶血率 <5 % ;Ames试验及微核试验均呈阴性 ;肌肉及骨内植入后无明显炎症反应 ,CPC与周围骨组织可达生物结合。　结论　自制 CPC无细胞毒性 ,无致突变、致畸、致癌作用 ,无溶血作用 ,植入后无炎症反应 ,可以与骨组织生物结合 ,具有良好的生物相容性和安全性