热疗联合顺铂对小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响及机制探讨

目的观察热疗联合顺铂对小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法将对数生长期的NCI-H446细胞随机分为A、B、C、D组,A组常规培养不进行特殊处理,B组将细胞消化后放置离心管中在42℃水浴中加热2 h,C组加入含2μg/mL顺铂的培养液4μg/孔,D组先经过水浴处理后加入顺铂。继续培养72 h后,采用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率,采用Western blot法检测各组细胞中的Bcl-2、Bax。结果 NCI-H446细胞凋亡率A组为4.25%±0.56%、B组为8.12%±0.64%、C组为10.02%±0.82%、D组为12.12%±0.49%,B、C、D组细胞凋亡率与A组比较,P均<0.05;D组与B、C组比较,P均<0.05。NCI-H446细胞中Bcl-2、Bax相对表达量A组分别为0.89±0.002 8、0.18±0.001 8,B组分别为0.61±0.004 2、0.32±0.002 0,C组分别为0.30±0.003 6、0.48±0.001 4,D组分别为0.21±0.001 7、0.64±0.002 5。B、C、D组与A组比较,P均<0.05;D组与B、C组比较,P均<0.05。结论热疗联合顺铂可诱导小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡,其机制与降低细胞中Bcl-2表达、升高Bax表达有关。     

川芎嗪、顺铂对小细胞肺癌NCI-H446细胞株体外增殖的影响

目的观察川芎嗪、顺铂对小细胞肺癌NCI-H446细胞株体外增殖的影响。方法将在体外培养的NCI-H446细胞分为川芎嗪组、顺铂组及川芎嗪联合顺铂组,分别加入相应药物,同时设空白对照组。MTT法检测各组细胞光密度值,进行集落形成实验,Western blot检测各组细胞的Cyclin D1、p16蛋白。结果加入川芎嗪、顺铂及川芎嗪＋顺铂培养后细胞变圆、坏死,存活的细胞减少。MTT实验显示在体外培养72 h及96 h时,川芎嗪组的光密度值分别为1.031±0.034、1.129±0.049,顺铂组分别为0.986±0.028、1.018±0.038,川芎嗪联合顺铂组分别为0.854±0.036、0.923±0.041,与空白对照组的1.336±0.067、1.437±0.045相比,P均〈0.05;川芎嗪联合顺铂组与单药组相比,P均〈0.05。细胞集落形成率川芎嗪组为17.9%±3.7%、顺铂组为15.8%±3.5%、川芎嗪联合顺铂组为11.2%±2.9%,与空白对照组的23.8%±4.2%相比,P均〈0.05;川芎嗪联合顺铂组与单药组相比,P均〈0.05。用药72 h后与对照组相比,川芎嗪组、顺铂组以及川芎嗪联合顺铂组p16蛋白表达水平升高（P均〈0.05）,川芎嗪联合顺铂组又高于单药组（P均〈0.05）;三组Cyclin D1蛋白表达水平下降（P均〈0.05）,川芎嗪联合顺铂组又高于单药组（P均〈0.05）。结论川芎嗪、顺铂均可抑制NCI-H446的增殖,二者联合应用抑制作用更明显,同时可降低细胞Cyclin D1的表达水平、升高p16的表达水平。     

DC-exosomes联合顺铂对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的观察利用人树突细胞(DC)制备的治疗性疫苗DC-exosomes联合顺铂对人脑胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将传代的U251细胞随机分为四组,A组加常规培养液,B、C、D组分别加DC-exosomes激活的淋巴细胞(2×106/mL)0.5 mL、顺铂(1 mg/mL)0.01 mL、DC-exosomes激活淋巴细胞(2×106/mL)0.5 mL+顺铂(1 mg/mL)0.01 mL培养2 d;用MTT法检测U251细胞光密度值(OD值)观察细胞增殖情况,用流式细胞仪检测U251细胞凋亡率。结果加入MTT培养12、24、36、48、60 h,A组细胞OD值分别为1.38±0.01、1.36±0.02、1.34±0.03、1.32±0.05、1.30±0.03,B组分别为1.30±0.02、1.10±0.03、0.90±0.04、0.75±0.03、0.62±0.03,C组分别为1.00±0.04、0.80±0.02、0.55±0.04、0.30±0.03、0.15±0.04,D组分别为0.75±0.04、0.50±0.04、0.38±0.02、0.21±0.02、0.05±0.03;B、C、D组与A组比较,P均<0.05;D组与B、C组比较,P均<0.05。培养24 h时,A、B、C、D组细胞凋亡率分别为0.5%±0.3%、18.6%±1.7%、36.9%±4.3%、57.5%±2.1%。B、C、D组与A组比较,P均<0.05;D组与B、C组比较,P均<0.05。结论 DC-exosomes疫苗联合顺铂可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖,并诱导其凋亡。     

汉防己甲素联合顺铂对 NCI-H446细胞的影响及相关机制分析

目的：研究汉防己甲素(tetrandrine,TET)联合顺铂(cisplatin,DDP)对人小细胞肺癌细胞株 NCI-H446体外抗肿瘤效果,探讨 TET 增强 NCI-H446细胞对 DDP 敏感性的可能机制。方法体外培养人小细胞肺癌株 NCI-H446;药物作用48 h 后,采用 CCK-8法测定各组细胞活力;Edu 染色观察各组细胞增殖情况;Hoechst 染色检测各组细胞凋亡情况;Western blot 检测各组磷酸化Akt、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、LC3等蛋白表达水平变化。结果低浓度的 TET 与 DDP 联合后可有效抑制 NCI-H446细胞株的增殖,诱导其凋亡;联合组半数抑制浓度较单药组显著降低;联合组磷酸化 Akt 表达显著下降,Bax、cleaved-caspase-3表达显著提高,抗凋亡蛋白 Bcl-2表达下降;自噬相关蛋白 LC3表达明显上调。结论低浓度 TET 与顺铂具有协同效应,其机制可能是通过上调促凋亡蛋白 Bax,下调抗凋亡蛋白 Bcl-2来诱导细胞凋亡;并且自噬可能在其中发挥重要作用。     

低剂量X射线照射对荷人小细胞肺癌(NCI-H446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响

目的 研究低剂量照射（LDR）对荷人小细胞肺癌（NCI-H446）裸小鼠移植瘤细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响。方法 对荷人小细胞肺癌裸小鼠进行全身深部X射线照射，采用原位杂交技术检测荷人小细胞肺癌裸小鼠移植瘤组织的p53、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平。结果 D1（75mGy）、D2（4Gy）照射后，小细胞肺癌细胞的p53、Bax的mRNA表达呈上升趋势，Bcl-2的mRNA表达呈下降趋势，但与假照组（0 mGy）比较，无明显差异；D1＋D2组的p53、Bax的mRNA表达明显增多，Bcl-2mRNA表达显著下降，与假照组（0mGy）比较有统计学差异（P〈0．05）。结论 LDR在一定程度上可能上调小细胞肺癌细胞的p53、Bax的mRNA表达，下调了Bcl-2mRNA的表达，同时对其后的大剂量照射有协同作用。     

Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨

目的 观察Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡中的作用,并探讨其机制.方法 将U87细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h.用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法分别检测U87细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白.结果 培养24、48、72、96 h,A组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031,B组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003,C组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016,A、B组与C组比较,P均＜0.05.A、B、C组细胞凋亡率分为0.96％±0.17％、26.51％±3.74％、8.76％±1.40％,A、B组与C组比较,P均＜0.05.与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均＜0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均＜0.05).结论 Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关.     

凋亡抑制基因XIAP与p53在非小细胞肺癌中表达的相关性

目的 研究凋亡抑制基因XIAP与抑癌基因p53在非小细胞肺癌中的表达及两者的相关性.方法 转染特异短发夹样RNA(XIAP shRNA)序列的表达载体至非小细胞肺癌细胞A549中,应用半定量PT PCR方法测定转染前后细胞中XIAP与p53的表达情况并进行对比.结果 PT-PCR结果显示XIAP在阳性转染组的表达较阴性转染组、未转染组细胞表达明显降低;p53在阳性转染组表达升高,加入顺铂后,阳性转染组XIAP mRNA表达较阴性转染组、未转染组细胞降低,p53在阳性转染加顺铂组的表达明显提高.结论 非小细胞肺癌中XIAP与p53呈负相关,高表达的XIAP抑制野生型p53的表达,反之XIAP受到抑制后野生型p53表达增高,促进非小细胞肺癌细胞凋亡.     

低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCI-H446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响

目的 研究低剂量照射（LDR）对荷人小细胞肺癌（NCI-H446）裸小鼠移植瘤细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响。方法 35只荷人小细胞肺癌（NCI-H446）裸小鼠，随机分为7个实验组，假照组（0mGy）；D1组（75mGy）；D2组（4Gy）；D1-12h＋D2组（D1照射后12h予以D2）；D1-24h＋D2组（D1照射后24h予以如）；D1-48h＋D2组（D1照射后48h予以D2）；D1-72h＋D2组（D1照射后72h予以D2）。各实验组不同方式照射后4d，荷瘤裸鼠全部处死，采用免疫组化技术检测荷瘤组织的P=53、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平。结果 D1组照射后，小细胞肺癌细胞的p53、Bcl-2的蛋白表达呈下降趋势，Bax蛋白表达呈上升趋势，但与假照组比较，无明显差异（P〉0．05）；D2组、D1＋D2组的p53、Bcl-2蛋白表达明显减少，Bax蛋白表达明显增多，与假照组比较差异显著（P〈0．05）；而D1＋D2组与D2组比较，差异显著（P〈0．05），以D1＋D2组p53、Bcl-2蛋白的表达减少、Bax蛋白的表达增多更为明显。结论 低剂量辐射可能在一定程度上下调了小细胞肺癌细胞的p53、Bcl-2的蛋白表达，上调了Bax蛋白的表达，同时对其后的大剂量照射有协同作用。     

EZH2抑制剂联合顺铂对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨EZH2抑制剂UNC1999联合顺铂对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法传代培养人肺癌A549细胞系,取生长良好的传代细胞分为对照组、联合用药组、顺铂组和UNC1999组。所有组均给予RPMI 1640培养液及10%的胎牛血清培养,对照组不加药液,联合用药组分别加入10、20、40、80、160 nmol/L UNC1999药液及2.5、5、10、20、40μg/ml顺铂药液;顺铂组分别加入2.5、5、10、20、40μg/ml顺铂药液;UNC1999组分别加入10、20、40、80、160 nmol/L的UNC1999药液;采用MTT比色法检测各组细胞增殖抑制率中IC50及联合指数(CI)。Western印迹法检测各组相关凋亡蛋白及细胞外调节蛋白激酶(ERK)及p-ERK的表达水平。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果与对照组相比,UNC1999组、顺铂组、联合用药组细胞增殖均受到不同程度抑制(P0.05)。各组细胞增殖抑制作用存在剂量-时间依赖关系,且UNC1999与顺铂存在协同作用。UNC1999组、顺铂组、联合用药组与对照组比较细胞凋亡差异显著(P0.05)。UNC1999组、顺铂组、联合用药组中凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达明显升高,p-ERK蛋白表达明显降低,联合用药组Bcl-2表达低于对照组(P0.05)。结论 EZH2特异性抑制剂UNC199可能通过抑制MAPK-ERK细胞通路起到抑制肺癌A549细胞增殖,促进其凋亡,与顺铂单药或联合均具有协同效应。     

Survivin反义寡核苷酸联合顺铂诱导肺癌细胞凋亡的研究

Survivin属于凋亡抑制蛋白（IAP）基因家族中的新成员，在多数肿瘤组织中高表达，但不表达于终末分化组织。该基因在肺癌组织的表达率达72％，且具有抗细胞凋亡和促进细胞增殖的双重作用。我们前期的研究已证实：Survivin反义寡核苷酸（ASODN）能有效抑制肺癌细胞株NCI-H446 Survivin mRNA和蛋白的表达，并诱导凋亡，抑制细胞生长。顺铂是目前治疗肺癌最常用的一线化疗药，但因严重毒副作用和耐药性的产生限制了它的应用。如何提高顺铂抗癌效果、减少耐药和毒副作用是改善肺癌预后的关键之一。本研究合成Survivin ASODN，转染人肺癌细胞株NCI-H446，并与顺铂联用，观察其抗癌效果，为肺癌治疗提供新的理论基础和实验依据。     

氯化甲基汞诱导NCI-H446细胞凋亡的体外实验研究

目的 探讨氯化甲基汞(MMC)诱导NCI-H446细胞凋亡发生的可能机制.方法 通过分子生物学方法,检测调控细胞凋亡的关键基因Bcl-2、Bax和caspase-3在mRNA水平的表达情况.结果 MMC组细胞Bcl-2 mRNA水平低于对照组,并存在着时间依赖性降低趋势,至24 h达到最低;Bax及caspase-3 mRNA水平高于对照组,并存在着时间依赖性增高趋势,至24 h达到最高.结论 MMC能够在体外诱导NCI-H446细胞发生凋亡.     

低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCI-H446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡的影响

目的探讨低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCIH446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡的影响。方法对荷人小细胞肺癌裸小鼠进行全身深部X射线照射,采用TUNEL(末端脱氧核甘酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)检测荷人小细胞肺癌裸小鼠移植瘤组织细胞凋亡的情况。结果D1组(75mGy)照射后,细胞凋亡指数(AI)呈增加趋势,但与假照组(0mGy)比差异不显著(P>0.05)。D2组(4Gy)、D1+D2组细胞凋亡指数均明显增加,与假照组(0mGy)比差异显著(P<0.010。而D1+D2组与D2组比较,D1+D2组细胞凋亡指数增加更为明显,有统计学差异(P<0.05)。结论75mGy照射对小细胞肺癌可能有一定的促细胞凋亡作用;大剂量照射及低剂量联合大剂量照射对小细胞肺癌均有促细胞凋亡作用,低剂量辐射与大剂量辐射有协同促小细胞肺癌细胞凋亡的作用。     

bcl-2对人小细胞肺癌细胞系H446/DDP多药耐药性的影响

目的探讨bc l-2表达上调对人小细胞肺癌(SCLC)多药耐药的影响及相关机制。方法通过定向克隆方法,构建bc l-2正义RNA真核表达载体pLXSN-bc l-2;同时,体外合成bc l-2反义硫代磷酸寡核苷酸(AS-PS-ODNs),然后采用脂质体分别将其转染至人SCLC H446细胞及H446/DDP细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和W estern b lot方法检测转染细胞中bc l-2 mRNA和蛋白的表达水平;流式细胞仪DNA倍性分析观察顺铂(DDP)诱导转染细胞凋亡情况。转染时细胞分3组,pLXSN-bc l-2转染组[或bc l-2 AS-PS-ODNs转染组(AS-PS-ODNs转染组)]、pLXSN转染组[或bc l-2无义硫代磷酸寡核苷酸转染组(NS-PS-ODNs转染组)]和对照组(H446细胞组、H446/DDP细胞组)。结果(1)W estern b lot检测结果表明,对照H446细胞组、pLXSN转染组、pLXSN-bc l-2转染组间Bc l-2蛋白表达水平差异有统计学意义(F=11 221,P<0.05)。转染pLXSN-bc l-2的H446细胞强表达Bc l-2蛋白(灰度值0.854±0.016),与对照H446细胞组(灰度值为0.103±0.005)相比差异有统计学意义(t=2.45,P<0.01);NS-PS-ODNs转染组的H446/DDP细胞,AS-PS-ODNs转染组的H446/DDP细胞,对照H446/DDP细胞组间Bc l-2蛋白表达水平差异有统计学意义(F=11 028,P<0.01)。转染bc l-2AS-PS-ODNs的H446/DDP细胞表达Bc l-2蛋白水平(灰度值为0.695±0.014),与对照H446/DDP细胞组(灰度值为0.942±0.018)相比,显著下降(t=2.26,P<0.01),但仍高于亲代H446细胞Bc l-2表达水平(t=2.31,P<0.01)。(2)流式细胞仪DNA倍性分析结果显示,转染pLXSN-bc l-2的H446细胞,经5μg/m l DDP诱导后凋亡率为(20.9±0.2)%,明显低于对照H446细胞组的(31.1±0.21)%,差异有统计学意义(t=2.45,P<0.01);5μg/m l DDP诱导转染AS-PS-ODNs的H446/DDP细胞的凋亡率为(31.5±0.4)%,对照H446/DDP细胞组的凋亡率为(9.0±0.1)%,转染细胞的凋亡率显著增加(P<0.05)。结论靶向性抑制抗凋亡相关基因bc l-2的表达可能是克服SCLC化疗耐药的重要的基因治疗方法之一。     

蛋白激酶C抑制剂联合顺铂治疗非小细胞肺癌的实验研究

目的 初步探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜红碱(CH)与化疗药物顺铂联合应用在非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中的作用及其可能的机制.方法 应用四甲基偶氮唑蓝试验及流式细胞术分别检测CH、顺铂以及CH与顺铂联用对人NSCLC细胞株A549增殖和凋亡的影响.用裸鼠移植瘤实验检测CH、顺铂以及CH与顺铂联用对A549细胞成瘤性的影响.应用人肺腺癌细胞株A549细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,用随机数字表法将24只倚瘤裸鼠分为CH组、顺铂组、CH+顺铂组及生理盐水对照组,每组5只,裸鼠分别腹腔注射CH、顺铂、CH+顺铂和生理盐水(共3周,顺铂及生理盐水每周注射1次,CH每周注射2次),观察移植瘤的生长情况.结果 CH可抑制NSCLC细胞株A549增殖,浓度增加其细胞毒作用亦增强,CH与顺铂联用呈协同或相加作用;CH组、顺铂组及CH+顺铂组A549细胞的凋亡率分别为(5.36±0.70)%、(5.23±0.55)%及(17.28±2.17)%,均高于对照组的(2.75±0.35)%(t=7.88,P＜0.05),CH+顺铂组A549细胞的凋亡率分别高于CH组及顺铂组(t=5.62,P＜0.05);裸鼠移植瘤体内实验结果表明,CH及顺铂均町抑制移植瘤的生长,CH+顺铂组的抑瘤率(80.5%)高于CH组(72.4%)及顺铂(64.3%)组(t=11.34,P＜0.01).结论 CH与顺铂联用对A549细胞及裸鼠移植瘤有显著的协同抗肿瘤作用,其作用机制可能是通过增强对A549细胞增殖的抑制以及诱导其凋亡而实现.     

人小细胞肺癌细胞H446及其MDR细胞H446/DDP受顺铂冲击后乳酸代谢与活性氧产生情况

目的通过检测人小细胞肺癌(SCLC)细胞H446及其获得性多药耐药(MDR)细胞H446/DDP受顺铂(DDP)冲击后乳酸代谢与活性氧(ROS)水平的变化,了解SCLC获得性MDR细胞的分子生物学变化,为逆转耐药提供理论和实验依据。方法体外常规培养SCLC细胞H446及H446/DDP细胞,经相同浓度(0.5μg/ml)、不同时间点的顺铂刺激后,分别应用干化学方法和激光共聚焦显微镜法检测乳酸浓度和ROS水平。结果顺铂刺激24h内,H446细胞和H446/DDP细胞乳酸浓度没有差异,但随着时间的延长,H446细胞乳酸产量显著性高于H446/DDP细胞。此外,顺铂刺激40min内,H446/DDP细胞ROS产量呈衰减趋势,而H446细胞ROS产量随着时间的延长而增加,15min时达到峰值,随后逐渐降低,并伴随细胞皱缩这一现象。结论较强的抗氧化损伤能力可能是SCLC获得性MDR抵御顺铂损伤的重要因素。     

白藜芦醇诱导小细胞肺癌H446细胞凋亡机制的研究

目的研究白藜芦醇对小细胞肺癌H446细胞增殖的抑制、凋亡诱导作用及作用特点,并探讨其可能的机制。 方法采用MTT法观察白藜芦醇对H446细胞的毒性以及细胞抑制率,筛选合适的药物作用浓度。通过不同浓度组及不同作用时间组观察白藜芦醇对H446细胞的毒性及细胞抑制率。采用流式细胞术检测不同浓度白藜芦醇及白藜芦醇不同作用时间对H446细胞的凋亡诱导作用、线粒体膜电位的变化以及细胞内ROS释放量的变化。 结果白藜芦醇对小细胞肺癌H446细胞增殖有明确的抑制作用,高浓度时可引起细胞死亡,随着药物剂量增加和作用时间的延长,抑制作用更强,具有剂量依赖和时间依赖的特点,差异有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇可诱导H446细胞凋亡、促进细胞内ROS的释放、使线粒体膜电位下降,随着药物剂量增加和作用时间延长,凋亡诱导作用更强、细胞内ROS释放量更多、线粒体膜电位下降速度更快,呈现剂量和时间依赖的特点,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论白藜芦醇对小细胞肺癌H446细胞的增殖具有明确的抑制作用,其诱导小细胞肺癌H446的凋亡可能与线粒体功能障碍有关。     

ABCE1基因的siRNA转染对肺癌NCI-H446细胞E-cadherin、β-catenin表达的影响

目的探讨ABCE1基因的siRNA转染对肺癌NCI-H446细胞E-cadherin、β-catenin表达的影响。方法将ABCE1基因的SiRNA表达质粒Si-1、Si-N转染入肺癌NCI-H446细胞,分别为Si-1组、Si-N组。另设正常对照组。用蛋白质印迹和半定量RT-PCR法检测转染后不同时点三组细胞的ABCE1蛋白、mRNA。用免疫组化ABC法检测E-cadherin、β-catenin。结果Si-1组转染96 h后ABCE1 mRNA仅为正常对照组的24.35%,ABCE1蛋白仅为正常对照组的40.82%。Si-1组细胞E-cadherin、β-catenin表达明显高于正常对照组和Si-N组。结论ABCE1基因的siRNA转染能上调肺癌NCI-H446细胞黏附因子E-cadherin、β-catenin的表达。