人脑胶质瘤中RhoA的表达及其临床意义

目的研究RhoA在人脑胶质瘤组织中的表达情况及其与病理分级的相关性,探讨RhoA在胶质瘤的诊断、恶性程度及预后判断中的临床意义。方法采用SABC免疫组化法、RT-PCR法对53例不同病理级别的星形细胞瘤及9例正常脑组织标本,进行RhoA蛋白和RhoA mRNA的检测。结果 (1)免疫组化结果显示53例胶质瘤组织中RhoA蛋白表达全部呈阳性,对照组正常脑组织存在弱表达或不表达。(2)不同级别星形细胞瘤标本的RhoA阳性细胞率、RhoA mRNA与GAPDH mRNA灰度比值均存在差异;Ⅰ级和Ⅲ、Ⅳ级之间差异有统计学意义(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级RhoAmRNA表达均高于Ⅰ级;Ⅱ级和Ⅲ、Ⅳ级之间差异有统计学意义(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级RhoAmRNA表达均高于Ⅱ级。(3)相关性分析:RhoA阳性细胞率和RhoA mRNA表达量与胶质瘤病理分级均呈正相关性(r=0.875,r=0.817,P<0.001)。结论 (1)RhoA在所有已检测的胶质瘤标本中均存在表达,且表达程度与胶质瘤病理分级呈正相关。检测RhoA的mRNA和(或)蛋白的表达,可以作为胶质瘤诊断、判断预后的一个可靠指标。(2)RhoA表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关,提示我们可以将其作为星形细胞瘤Ⅰ～Ⅳ级新的有效的诊断标记物,同时作为常规组织病理学的分级标准的补充。这将有助于描述肿瘤的生物学行为特征,选择术后进一步的治疗方案。     

siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

生长抑制因子4基因表达对K562细胞生长的影响

目的 研究生长抑制因子4（ING4）基因表达对K562细胞增殖的影响。方法 将经过定点突变技术人源化改造的ING4（鼠→人）生长抑制因子4基因酶切并连接到pAdTrack-CMV转移质粒上，然后与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack—CMV—hING4，将它转染QBI-293A细胞后收获重组腺病毒Ad—hING4（以下简称为Ad-ING4）。将Ad-ING4感染K562细胞，光学显微镜下观察病毒感染前后细胞形态的变化，免疫细胞化学分析凋亡因子的改变，激光扫描共聚焦显微镜观察K562细胞的凋亡，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率。结果 成功构建了人ING4腺病毒质粒，获得高滴度的重组腺病毒Ad-ING4，用它感染K562细胞72h后，FCM法测定细胞凋亡率为19．7％，与空病毒对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01），ING4基因能下调K562细胞bcl-2的表达并上调bax的表达，多种方法检测结果表明ING4基因能抑制K562细胞生长，诱导凋亡。结论 重组腺病毒Ad—ING4可以显著抑制K562细胞的生长。     

染色体22q12上THOC5和ADRBK2基因在人脑胶质瘤组织中mRNA表达

目的观察位于染色体22q12上的THOC5和ADRBK2基因在人脑胶质瘤肿瘤组织中mRNA表达。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及图像分析方法,检测17例人脑胶质瘤肿瘤组织和8例正常人脑组织中THOC5和ADRBK2基因mRNA表达。基因表达水平用THOC5或ADRBK2基因/β-肌动蛋白(β-actin)灰度比值×100表示。结果ADRBK2基因在正常人脑组织和人脑胶质瘤肿瘤组织中,均存在弱表达,统计分析显示无显著性差异(P0.05);THOC5基因在正常人脑组织中弱表达,在人脑胶质瘤肿瘤组织中高表达。统计分析显示:人脑胶质瘤肿瘤组织中THOC5基因mRNA表达与正常人脑组织中THOC5基因mRNA表达比较,有显著性差异(P0.05)。结论THOC5基因高表达可能与胶质瘤的发生、发展相关。     

凋亡相关基因Survivin在神经胶质瘤的表达及意义

目的 通过观察神经胶质瘤中Survivin的表达状况，探讨Survivin在神经胶质瘤中的表达特点及其与肿瘤恶性度的关系。方法 采用免疫组化二步法对恶性度不同的神经胶质瘤石蜡标本中Suvivin进行检测。结果 在56例胶质瘤中32例观查到了Survivin蛋白表达。Survivin在低度恶性和高度恶性胶质瘤中的阳性表达分别为44．8％和70％。结论 Survivin阳性表达随神经胶质瘤恶性度的升高而升高，是一种能反映胶质瘤恶性度的客观指标，并与其组织病理级别和分化程度有关。     

凋亡抑制基因Livin与其拮抗素Smac基因在急性白血病中的表达

Livin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins,IAPs）的最新成员,它通过抑制半胱天冬酶活化蛋白（second mitochodria—derived activator of caspase,Smac）和半胱天冬酶-3、7、9酶的活性而产生抗凋亡作用。Livin在多种肿瘤组织中表达,且其高表达常提示预后不良,但在白血病患者中表达及意义尚无明确结论,我们应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）研究急性白血病（AL）患者在初治、化疗缓解后、复发时Livin及其拮抗素Smac基因表达水平的变化,探讨其在急性白血病中表达的相互关系,对白血病发病机制及预后因素作初步的研究。     

胶质瘤患者RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化的研究

目的 探讨RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因mRNA表达水平和基因启动子区CpG岛甲基化程度及其与启动子甲基化的关系。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测28份胶质瘤组织和4份正常脑组织中RASSF1A基因mRNA相对表达水平;用甲基化特异性PCR方法研究胶质瘤组织、正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果 RASSF1A mRNA在4份正常脑组织中全部表达;在脑胶质瘤中表达缺失率为21.4％(6/28),且表达量低于正常脑组织,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度间的差异无显著意义(P>0.05)。按病理学分类,胶质母细胞瘤与少突胶质肿瘤的差异有显著意义(P=0.011)。脑胶质瘤中RASSF1A基因启动子发生甲基化的频率为39.3％(11/28),正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动了未发生甲基化。11份启动子区甲基化的胶质瘤标本中,5份同时伴mRNA表达缺失(P=0.022)。结论 RASSF1A基因启动了在胶质瘤中发生异常甲基化。尽管RASSF1A mRNA在脑胶质瘤中表达缺失并不广泛,但其表达普遍下调。推测启动子区CpG岛甲基化可能是导致RASSF1A基因在胶质瘤中表达缺失或表达水平下调的一种机制。     

血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的：构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法：实验于2004—02／12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成，表达质粒由中山大学医药分子实验室保存，肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因，连接PGEN-T载体，在16℃下以进行16h连接反应，转化大肠杆菌DH5α，对所获克隆扩大培养，提取质粒经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切鉴定。将带有插人片段的重组质粒命名为PGEN-Tendo。对其阳性克隆扩大培养，大量提取质粒，以T7，SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEN-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切后定向连接，转化人大肠杆菌DH5α，聚合酶链反应鉴定阳性克隆，命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养，经42℃热诱导4h后收菌，对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎，将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果：反转录-聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp。用EeoRⅠ，BamHⅠ双酶切，10g／L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEN-T载体片段，说明内皮抑素已成功构建在PGEN-T载体上。经全自动正、反向测序，Genbank分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因，该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A，但编码的氨基酸都是精氨酸，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，出现特异性蛋白质条带，大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达，表达量为14．5％。结论：克隆的552bp的内皮抑素基因，经与GenBank中人胶原ⅩⅧcDNA中内皮抑素基因比较，基因序列基本一致，说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达，为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

乙酰肝素酶基因在U251胶质瘤细胞株中的表达

目的：探讨乙酰肝素酶基因（HPSE）在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达水平.方法：采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学方法分别检测HPSE基因及其蛋白在U251细胞株中的表达.结果：U251细胞株中HPSE基因mRNA及蛋白阳性表达，蛋白定位于瘤细胞的细胞质中.结论：U251细胞存在HPSE基因的表达，HPSE可能对于维持U251细胞株的生物学特性具有重要作用；并可能是恶性胶质瘤基因治疗的一个良好靶点.     

胃癌组织中MACC1基因的表达及意义

摘要:目的：探讨胃癌组织中结肠癌转移相关基因（MACC1）的表达,评价其在胃癌进展、侵袭和转移中的作用。 方法：用RT-PCR检测60例胃癌患者癌组织和癌旁组织中MACC1 mRNA的表达情况,分析其与临床病理参数的相关性。 结果：MACC1 mRNA在胃癌组织中阳性率为70.0%(42/60),显著高于癌旁组织［13.3%(8/60),χ²=37.34,P＜0.01］,和正常胃黏膜组织［0%(0/20),χ²=26.73,P＜0.01］。MACC1 mRNA表达与胃癌浸润深度、TNM分期、分化程度及有无淋巴结转移呈正相关(P均＜0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小无关。 结论: MACC1 mRNA高表达与胃癌进展、侵袭及转移相关,可作为胃癌诊断和预后评估的分子标志物。     

生长抑制因子4基因在胃癌中的表达及临床意义

目的 检测生长抑制因子4（ING4）在胃癌患者组织及外周血中的表达,探讨其与胃癌发生、发展的相关性及在胃癌诊疗中的应用。 方法 收集30例胃癌患者手术切除的癌组织、对应的癌旁组织和外周血,用RT-PCR、实时定量RT-PCR、巢式RT-PCR检测ING4 mRNA表达;用western blot和免疫组织化学法在蛋白质水平上进行验证,分析ING4在胃癌中的表达水平与临床病理因素的相关性。 结果 RT-PCR和定量结果显示76.7%（23/30）的胃癌组织ING4表达低于对应的癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05); western blot 和免疫组织化学法在蛋白质水平上证实了胃癌组织较癌旁组织中ING4的表达水平下降。胃癌组织ING4的表达与肿瘤分化状态和复发相关,但与临床分期无关。分化水平越低,ING4 mRNA表达越低（P＜0.05);复发的患者癌组织ING4 mRNA表达显著低于未复发患者（P＜0.05)。胃癌患者外周血NG4 mRNA的表达也显著低于健康人。 结论 胃癌组织ING4的表达下调,且与胃癌的分化与复发相关,ING4的基因和蛋白质水平检测可能作为胃癌病程进展或复发监测的新指标。     

基因芯片用于活化支气管上皮细胞基因表达的研究

目的探讨基因芯片筛选肿瘤坏死因子(TNF)-α活化后支气管上皮细胞基因表达的变化。方法提取支气管上皮细胞系(BEAS-2B细胞)总RNA,用基因芯片检测正常培养和经TNF-α活化的BEAS-2B细胞基因表达,对上调表达的基因用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)确证,用流式细胞微珠方法(CBA)检测TNF-α活化的BEAS-2B细胞培养液中相关细胞因子浓度。结果TNF-α活化后BEAS-2B细胞中细胞间黏附分子(ICAM)-1、白细胞介素(IL)-8、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、TNF-α、IL-6基因表达显著上调(分别上调6·5、8·2、3·1、4·9和3·5倍),表达上调的基因用RT-PCR确证结果基本一致。TNF-α活化后BEAS-2B细胞培养液中细胞因子的分泌(BEAS-2B细胞培养过程中有、无TNF-α存在,IL-6、IL-8和MCP-1的分泌分别为:(117·83±18·20)ng/L和(1771·33±312·67)ng/L,P<0·001;(277·97±50·76)ng/L和(7579·20±797·15)ng/L,P<0·001;(741·53±129·91)ng/L和(12228·57±1897·58)ng/L,P<0·001),与相应基因的表达一致。结论用基因芯片方法筛选活化后支气管上皮细胞基因表达对研究支气管上皮在气道性疾病中的作用具有重要意义。     

NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化

为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系,应用基因重组技术建立了竞争性RT-PCR定量检测WT1基因表达的方法,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化.结果发现,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,12,24小时后每μg总RNA中WT1基因的分子数分别为4×106,1.56×106和0.4×106,与CD11b的变化情况相一致.结论提示,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1基因定量检测与细胞表面抗原检测结合有助于白血病细胞诱导分化的研究.     

子宫内膜异位症中基质金属蛋白酶-14基因的表达

目的：探讨基质金属蛋白酶-14（MMP-14）基因在子宫内膜异位症发生中的作用。方法：采用免疫组织化学SP法研究25例子宫内膜异住症和22例正常子宫内膜组织中MMP-14基因的蛋白表达情况；采用RT-PCR方法研究33例子宫内膜异住症的异位子宫内膜组织和30例正常子宫内膜组织中MMP-14基因的mRNA表达情况。结果：子宫内膜异住症组织中MMP-14基因的蛋白表达水平和mRNA表达水平均明显高于正常子宫内膜组织（P〈0．05）。结论：MMP-14基因在子宫内膜异住症的发病过程中可能起重要的作用。     

血小板源性生长因子-BB在肺癌患者中的表达及意义

目的探讨肺癌患者血清及外周血单个核细胞中血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)的表达水平及其意义。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测30名肺癌患者和20名正常对照者外周血血清中PDGF-BB的水平,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测受试者外周血单个核细胞(PBMCs)中PDGF-B链mRNA的表达水平。结果肺癌患者和正常对照者血清PDGF-BB水平分别为(389.64±36.42)、(28.36±8.35)pg/ml,外周血单个核细胞PDGF-B链mRNA的表达水平分别为(0.9287±0.0942)、(0.2275±0.0384)灰度比值,比较差异有统计学的意义(P<0.01)。结论检测血清PDGF-BB及PBMCs中PDGF-B链mRNA表达水平可能对肺癌诊断具有一定临床指导意义。     

不同麻醉方法对人外周血淋巴细胞促炎性细胞因子基因表达的影响

目的：研究复合麻醉中人外周血淋巴细胞IL－8,IL－1β基因表达,探讨异氟醚吸入和硬膜外阻滞对外周血炎性反应的影响。方法：24例肝脏部分切除手术病人随机分为异氟醚组（n=12)和硬膜外组（n=12),在麻醉诱导后即刻和4h分别取静脉血20ml用外周血淋巴细胞分离液（Ficoll)进行梯度离心,从收获的淋巴细胞中提取RNA,逆转录合成cDNA,PCR后电泳扫描求积,检测淋巴细胞IL－8,IL－1β和mRNA表达结果：异氟醚组麻醉维持4h后比麻醉诱导后即刻IL－8,IL－1β的表达增加,（P＜0．05）,硬膜外组麻醉维持4h与麻醉诱导后即刻ILIL－8,IL－1β的表达无明显变化（P＞0．05）,结论：复合麻醉中吸入异氟醚能增强肝脏部分切除病人外周血淋巴细胞促炎性细胞因子mRNA表达,即在转录水平上,异氟醚能增强外周血炎性反应,而硬膜外阻滞无此效应。     

Aurora-A在脑胶质瘤中的表达及生物学意义

目的探讨Aurora-A基因在脑胶质瘤中的表达情况,以及在胶质瘤发生、进展及预后中的生物学意义。方法选取2011年3月至2013年4月在郑州大学第五附属医院神经外科行手术治疗的脑胶质瘤患者63例,利用SP法进行免疫组化检测Aurora-A基因蛋白表达情况,并分析Aurora-A表达与脑胶质瘤患者临床病理之间的关系。结果 AuroraA在不同病理级别脑胶质瘤中均有阳性表达,随着病理级别增加,阳性表达率逐渐增加,并且不同病理级别表达阳性率比较差异有统计学意义（P〈0.05）;Aurora-A阳性表达与不同病理级别、肿瘤复发、生存时间相关（P〈0.05）,胶质瘤病理级别越高、术后发生复发、生存期〈2年的患者,Aurora-A阳性表达越高。结论 Aurora-A在脑胶质瘤的发生、进展中发挥了重要作用,对于判定脑胶质病理级别、进展程度和预后具有重要意义,可能为脑胶质瘤基因靶向治疗提供新的靶点。     

抗凋亡基因survivin在急性白血病细胞表达及其临床意义

目的　探讨急性白血病 (AL)原代细胞survivin基因表达及其与AL疗效的关系。方法　应用RT PCR方法检测 50例初发AL患者survivin基因mRNA表达。结果　AL细胞survivinmRNA阳性率为 82 .0 % (50例中 41例 )。survivinmRNA阳性表达在急性淋巴细胞白血病细胞 (89.5 % )较在急性非淋巴细胞白血病 (ANLL)细胞 (75 .0 % )稍多见 ,但均高于正常对照组 (33 .3 % ) ,P值分别 <0 .0 1 ,<0 0 5。在 2 2例ANLL患者白血病细胞中 ,survivinmRNA表达阴性者接受 1个疗程化疗后骨髓缓解(BMR)率 (83 .3 % )明显高于阳性者 (2 5 .0 % ,P =0 .0 2 3) ;1 3例ANLL患者接受高三尖杉酯碱和阿糖胞苷联合治疗 ,survivinmRNA阴性表达者BMR率 (1 0 0 .0 % )高于阳性表达者 (2 7.3 % ) ;survivin/ β actin >0 .6者BMR率低。结论　survivin基因在AL细胞高表达 ,可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一     

人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建

本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829bp和784bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnI/EcoRI对获得的2个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3Basic荧光素酶报道重组子;经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400bp左右设计了5对3′端平齐、5′端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112bp、1 703bp、1 290bp、784bp和496bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定。结论:成功克隆了长度为2.5kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pGL3-Basic荧光素酶报道重组子。     

成人和儿童ALL7种常见融合基因表达的比较

目的:比较成人和儿童ALL7种常见融合基因表达的差异.方法:利用RT-PCR技术检测7种常见融合基因.结果:在233例成人ALL中62例融合基因检测阳性,其中BCR/ABL 31例,MLL相关19例,E2A/PBX1、SIL/TAL1各5例,SET/CAN、TIS/ERG各1例,未栓出TEL/AML1阳性病例;在215例初诊儿童ALL中35例检测阳性,其中BCR/ABL 3例,E2A/PBX1 8例,MLL相关11例,SIL/TAL1 5例,TEL/AML1 6例,TLS/ERG 2例,未检出SET/CAN阳性病例.成人ALL中BCR/ABL最为常见,而在儿童ALL中表达较低,差异有统计学意义(P<0.01),MLL相关融合基因、E2A/PBX1、SIL/TAL1、TEL/AML1、SET/CAN、TLS/ERG等在成人和儿童表达差异不显著.结论:成人和儿童ALL融合基因表达各有侧重,在初诊时进行快速检测可进行较为准确的分型.