弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的　扩增弓形虫表面抗原P2 2基因编码序列 ,并进行表达和鉴定。　方法　设计合成引物 ,PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P2 2基因编码序列 ,克隆入载体pET 3 2a ,转化大肠埃希菌BL2 1,IPTG诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE和Westernblot鉴定。　结果　从弓形虫基因组DNA中扩增出P2 2基因编码序列 ,并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P2 2。　结论　成功获得弓形虫表面抗原P2 2的表达产物 ,为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。     

弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的 扩增弓形虫表面抗原P22基因编码序列，并进行表达和鉴定。方法 设计合成引物，PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P22基因编码序列，克隆人载体pET-32a，转化大肠埃希菌BL21，IPTG诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 从弓形虫基因组DNA中扩增出P22基因编码序列，并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P22。结论 成功获得弓形虫表面抗原P22的表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。     

刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列，并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析。方法将NCBI GenBank中登录的弓形虫MDH EST序列进行比对、拼接和电子延伸，发现近5’末端的部分核酸序列缺失。基于分析，设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA→UGA)，使经RT-PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF。之后对MDHCDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析。结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp，推导翻译出的蛋白质有316个aa组成，约35kDa，与预期大小接近。保守功能域分析表明，弓形虫MDH最接近类-乳酸脱氢酶型(lactate dehydrogenase-like)MDH，其准确定名缩写为LDH-like MDH，同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征。弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外，还与很多细菌等物种同源，但与人的同源性最低(22％)。弓形虫MDH cDNA序列在NGBI GenBank中登录号为AY650028，对应aa序列的登录号为AAT67462。结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列。MDH是三羧酸循环中的重要酶类，该酶活性的改变。将直接影响弓形虫的存活。弓形虫MDHaa序列与人MDH蛋白间的同源性很低，提示基于MDH蛋白作为药靶，经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的克隆及序列测定

目的克隆弓形虫表面抗原P22编码基因片段并进行序列测定。方法设计合成1对引物,采用PCR法扩增出P22目的基因片段,以低熔点琼脂糖回收纯化,并以限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切后,插入质粒载体p5．6的多克隆位点,构建重组体p5．6／P22,并转化大肠杆菌DH5α,快速酸法初筛阳性重组子,并以PCR法与限制性酶切分析对阳性克隆进一步鉴定。被鉴定的重组子以双脱氧链终止法进行序列测定。结果从弓形虫核酸提取物中扩增出约593bpDNA条带,与预期扩增片段大小相符,空白对照无特异性扩增条带;所构建p5．6／P22重组体阳性克隆经双酶切与PCR鉴定与预期结果一致;序列测定的结果确证了插入片段的正确性。结论体外成功扩增、克隆了弓形虫表面抗原P22编码基因片段,并经序列分析所验证,为弓形虫P22表面抗原的表达以及弓形虫疫苗的制备作好铺垫。     

弓形虫表面抗原P22蛋白的研究进展

*　弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性寄生于人和多种动物组织有核细胞内的原虫,呈世界性分布。近年来关于弓形虫细胞表面抗原作为诊断试剂及免疫疫苗的双重潜在价值得到广泛研究,主要发现有5种表面抗原:P22、P23、P30、P35、P43。其中P22基因依据克隆的顺序也被称为SAG2。本文就弓形虫重要抗原P22的基因和蛋白结构,及该抗原在弓形虫虫株的分型、血清诊断、疫苗方面的研究作简要介绍。1　关于弓形虫P22基因弓形虫的生活史中除了合子期外,其他期的核均为单倍体。已经确定的染色体有8条, 各编码染色体分子质量单位分别为: 2.0、2.4、2.6、…     

弓形虫表面抗原P22蛋白的研究进展

弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性寄生于人和多种动物组织有核细胞内的原虫，呈世界性分布。近年来关于弓形虫细胞表面抗原作为诊断试剂及免疫疫苗的双重潜在价值得到广泛研究，主要发现有5种表面抗原：P22、P23、P30、P35、P43。其中P22基因依据克隆的顺序也被称为SAG2。本文就弓形虫重要抗原P22的基因和蛋白结构，及该抗原在弓形虫虫株的分型、血清诊断、疫苗方面的研究作简要介绍。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的 克隆刚地弓形虫RH株致密颗粒抗原（Dense granule antigen,GRA6)分子基因，为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。方法 根据已知的GRA6序列合成一对引物，抽提弓形虫速殖子mRNA，以速殖子mRNA为模板，通过反转录PCR（RT-PCR）扩增出GRA6的cDNA条带，目的基因DNA条带被克隆到质粒pUC19中形成重组质粒，对重组质粒DNA进行纯化，并对目的基因片段进行核苷酸序列分析，结果 通过RT-PCR从mRNA中扩增出一条分子量约700bp的DNA条带，核苷酸序列分析表明，GRA6分子基因的开放的阅读框全长为693bp，编码230个氨基酸分子，与已报道的RH株GRA6分子具有100%的同源性。结论 本研究获得了刚地弓形虫RH株的GRA6分子基因，为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D的生物信息学分析

目的预测刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(Toxoplasma gondii surface antigen glycoprotein 1-related sequences)SRS47D的结构、修饰位点和免疫原性。方法利用在线软件ProtParam、ProtScale、SignalP分别预测SRS47D的理化参数、亲/疏水性、信号肽;利用SOPMA、ESPriit 3.0、Bcepred预测SRS47D蛋白的二级结构及表面可极性,利用COLIS、TMHMM预测其卷曲螺旋和跨膜结构域;利用KinasePhos、NetOGlyc、NetNGlyc、NetCGlyc、和NetPhos分析其修饰位点;利用SWISS-MODEL、VAST预测其三级结构及其与SAG1三级结构的差异,利用ABCpred和Syfpeithi预测其B、T细胞表位。结果 SRS47D蛋白含有376个氨基酸残基,分子式为C_(1745)H_(2797)N_(469)O_(587)S_(17),相对分子质量约为40×10~3,理论等电点为4.96;疏水值为71.60,总平均亲水性为-0.405。在SRS47D蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为23.14%、19.68%、2.39%和54.79%。SRS47D蛋白具有信号肽序列,无跨膜结构区,具有18个亲水区域(临界值为1.9)、8个柔性区域(临界值为2)和17个表面可及性区域(临界值为1.9)。SRS47D蛋白翻译后修饰位点中包含两个糖原合成酶激酶位点和两个O-GlcNAc糖基化位点,无N-GlcNAc和C-GlcNAc糖基化位点。与弓形虫表面抗原糖蛋白1(SAG1)蛋白三级结构比对,SRS47D在β折叠处存在重叠。ABCpred和Syfpeith预测SRS47D蛋白有24个限制性CTL细胞表位、13个限制性Th细胞表位和10个B细胞抗原表位。结论 SRS47D蛋白含丰富的B、T细胞表位,免疫原性好,可能成为弓形虫病疫苗候选分子。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒，为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。方法 用弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，酚／氯仿法抽提弓形虫基因组DNA；用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表而抗原P30、P22的基因片段，分别重组入pMD18T载体中。将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切，定向克隆入pUC18克隆载体中，pUC18-P30-P22中的P30P22片段经酶切、纯化后，亚克隆入pcDNA3．1(-)真核表达载体，用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段；大小均与预测值相符；克隆pUC18-P30P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基冈大小一敛：经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论 成功构建弓形虫pUC8-P30P21重组质粒和pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因,构建表达质粒pBK/P22,并对其在大肠杆菌(E.coli)中的表达作初步研究. 方法以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点,构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH 5α,快速酚法初筛阳性重组子,阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导在E.coli DH 5α中表达,表达产物以SDS-PAGE与免疫印迹分析. 结果双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得约593 bp的P22编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建pBK/P22重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物的大小约28 ku. 结论成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒,诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白,为抗原免疫特性的研究奠定了基础.     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的 亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因，构建表达质粒pBK/P22，并对其在大肠杆菌（E.coli)中的表达作初步研究。方法 以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，在以低熔点琼脂糖回收纯化后，插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点，构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导在E.coliDH5α中表达，表达产物以SDS－PAGE与免疫印迹分析。要双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得约593bp的P22码基因片段，与预期片段大小相符；所构建pBK/P22重组性体阳性克隆以双酶切和PCR鉴定与预期结果一致；SDS－PAGE与免疫印迹显示，表达产物的大小约28ku。结论 成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒，诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白，为抗原免疫特性的研究奠定了基础。     

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的　选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法　根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果　酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论　成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。     

刚地弓形虫速殖子表面抗原的研究及应用

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫, 能感染包括人在内的所有温血动物。近年来弓形虫速殖子表面抗原已成 为候选的诊断和疫苗抗原, 主要包括P30、 P22、 P43、 P35和P23等, 本文就此做一综述。     

刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D的生物信息学分析北大核心CSCD

目的预测刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(Toxoplasma gondii surface antigen glycoprotein 1-related sequences)SRS47D的结构、修饰位点和免疫原性。方法利用在线软件ProtParam、ProtScale、SignalP分别预测SRS47D的理化参数、亲/疏水性、信号肽;利用SOPMA、ESPriit 3.0、Bcepred预测SRS47D蛋白的二级结构及表面可极性,利用COLIS、TMHMM预测其卷曲螺旋和跨膜结构域;利用KinasePhos、NetOGlyc、NetNGlyc、NetCGlyc、和NetPhos分析其修饰位点;利用SWISS-MODEL、VAST预测其三级结构及其与SAG1三级结构的差异,利用ABCpred和Syfpeithi预测其B、T细胞表位。结果 SRS47D蛋白含有376个氨基酸残基,分子式为C1745H2797N469O587S17,相对分子质量约为40×103,理论等电点为4.96;疏水值为71.60,总平均亲水性为-0.405。在SRS47D蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为23.14%、19.68%、2.39%和54.79%。SRS47D蛋白具有信号肽序列,无跨膜结构区,具有18个亲水区域(临界值为1.9)、8个柔性区域(临界值为2)和17个表面可及性区域(临界值为1.9)。SRS47D蛋白翻译后修饰位点中包含两个糖原合成酶激酶位点和两个O-GlcNAc糖基化位点,无N-GlcNAc和C-GlcNAc糖基化位点。与弓形虫表面抗原糖蛋白1(SAG1)蛋白三级结构比对,SRS47D在β折叠处存在重叠。ABCpred和Syfpeith预测SRS47D蛋白有24个限制性CTL细胞表位、13个限制性Th细胞表位和10个B细胞抗原表位。结论 SRS47D蛋白含丰富的B、T细胞表位,免疫原性好,可能成为弓形虫病疫苗候选分子。     

弓形虫主要表面抗原P30的克隆、表达与纯化

目的通过分子克隆技术获取弓形虫主要表面抗原P30蛋白。方法自行设计引物,通过PCR扩增获得P30基因片段,采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,定向克隆到载体pThioHis中,转化大肠杆菌Top10,利用酶切、DNA序列分析鉴定阳性克隆,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,融合蛋白通过镍结合树脂(ProBond~(TM)Resin)进行纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)鉴定。结果PCR、酶切、连接的产物经电泳鉴定,均与预期设计相符合。DNA序列分析结果表明,除一个同义突变,其余均与文献报道相符。IPTG诱导表达后经层析纯化获得46kDa含P30的融合蛋白。结论通过定向克隆、表达与纯化,获得含P30的融合蛋白。     

刚地弓形虫重组主要表面抗原(P30)激活巨噬细胞的杀虫活性

以免疫化学分析鉴定的刚地弓形虫表面抗原有4种放射性碘蛋白,因分子量的不同名为P43,P35,P30和P22。已知P30对弓形虫病具有诊断和保护作用。P30是由糖磷脂固定在膜上,它为速殖子期所特有。将聚合酶链反应扩增的P30编码序列在质粒pGEX-1中克隆,并在大肠杆菌中以与谷胱     

刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定

目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。     

以不溶性谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白形式表达刚地弓形虫主要表面抗原(P30)基因

主要表面抗原P30为刚地弓形虫中主要抗原成分,具有很强的免疫原性及免疫保护性,为很有前途的保护性抗原成分。作者报