大肠杆菌O157特异基因的PCR检测方法

目的：建立一种灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157的PCR方法。方法：针对大肠杆菌O157特异性基因rfbO157设计引物，扩增-497bp的O157标识序列。结果：应用该PCR反应体系，对4株O157菌株和14株非O157菌株扩增结果表明，O157菌株均扩增出预期的497bp片段，14株非O157菌株则为阴性。纯菌液检测灵敏度为60cfu／PCR反应，模拟混合菌液检测灵敏度为400cfu／PCR反应。结论：该方法用于肠出血性大肠杆菌O157的检测鉴定简便、快捷，具有很高的特异性和灵敏度，为O157的临床辅助诊断提供了有力手段。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7多重PCR快速检测研究

[目的]建立能快速、特异检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7的多重PCR技术。[方法]选用针对大肠杆菌O157志贺样毒素1、2(slt1/slt2)基因、溶血素(hlyA)基因、和O157特异性基因(rfbE)的4对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了猪肉模拟样品检测。[结果]该方法扩增目的基因片段分别为348,584,250bp和497bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为103cfu/ml,猪肉模拟样品37℃预增菌4h后检测灵敏度能达到100cfu/ml。[结论]初步建立了快速、灵敏、特异地测定肠出血性大肠杆菌EHECO157︰H7的多重PCR检测技术。     

荧光定量PCR快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O104

目的建立针对肠出血性大肠杆菌O104的荧光定量PCR快速检测方法。方法针对O104的wzx保守基因,设计特异性引物和探针,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外34株肠道致病菌评价检测方法的特异性;建立了肠出血性大肠杆菌O104感染食品的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了荧光定量PCR快速检测肠出血性大肠杆菌O104的方法。每次检测最低限为12.0copies,特异性为100%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中具有应用前景。     

熔解曲线分析方法甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的:采用熔解曲线分析技术,建立一种快速、简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7方法。方法:选取肠出血性大肠杆菌O157:H7编码脂多糖基因(rfbE)和编码鞭毛抗原基因(fliC)作为检测靶基因,建立荧光PCR反应体系。结果:通过多种标准菌株试验,结果显示所建立的熔解曲线分析法可特异性地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7;纯培养的灵敏度达到2.8×101cfu/ml;检测108例临床样本,其中18例肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性,3例为肠出血性大肠杆菌O157:非H7阳性,与常规培养方法的符合率达到100%。结论:本方法可简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7,结果可靠,通过进一步增加反应体系中引物的数量可同时对肠出血性大肠杆菌其他血清型进行鉴定。     

双重实时荧光PCR快速检测O157大肠杆菌的初步研究

[目的]建立双重实时PCR体系,实现对O157大肠杆菌rfbE和stx2基因的同步检测。[方法]根据GenBank公布的O157大肠杆菌rfbE和stx2基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和TaqMan探针,并对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测O157大肠杆菌的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。[结果]所有O157大肠杆菌菌株的检测结果均为阳性,而所有其他菌株检测结果均为阴性;该方法对O157大肠杆菌纯培养的检测范围为10^0～10^6cfu/μl,重复性检测的变异系数均小于5%。对模拟污染牛奶样本的检测范围为10^2～10^6cfu/μl。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。[结论]基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系可同步检测O157大肠杆菌rfbE和stx2基因,具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于O157大肠杆菌食物中毒的快速诊断和食品微生物检测。     

大肠杆菌O_(157)∶H_7实时荧光PCR快速检测方法的建立

[目的]利用特异性荧光探针为特点的TaqM an荧光定量PCR技术,建立大肠杆菌O157∶H7污染的快速敏感特异的检测方法。[方法]以大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以大肠杆菌O157∶H7菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以大肠杆菌O157∶H7和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。[结果]建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6μmoL/L、0.8μmoL/L,Mg2+浓度为4mmoL/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除大肠杆菌O157∶H7出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限为17 cfu/mL。同一样品重复检测3次C t值的变异系数均小于5%。[结论]该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

复合探针实时荧光PCR检测大肠杆菌O157:H7

目的建立一种快速、准确、特异的肠出血性大肠杆菌O157:H7的定量检测方法。方法以rfbE基因作为待检靶基因,根据复合探针荧光定量分析原理设计检测引物和探针,建立检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量PCR方法。并对本方法检测的特异性、灵敏度、重复性等进行评价。结果所有O157:H7的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达10 cfu.mL-1,定量检测的批间和批内差异均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×101cfu.μL-1的细菌。结论本文建立的复合探针实时荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地对大肠杆菌O157:H7进行定量分析,为大肠杆菌O157:H7的检测提供了新的方法。     

用PCR-ICT方法检测肠出血性大肠杆菌O157

目的初步建立肠出血性大肠杆菌O157的聚合酶链式反应-免疫层析检测(PCR-ICT)技术。方法根据肠出血性大肠杆菌O157的溶血性基因(hlyAB)序列设计特异性引物和探针,并分别经生物素和地高辛标记,用胶体金免疫层析技术检测PCR扩增产物。结果用建立的PCR-ICT方法检测5株O157H7血清型大肠杆菌均得到阳性结果,检测5株非O157血清型普通大肠杆菌和5株其他肠杆菌菌株均得到阴性结果,检测冻虾仁、冻贝肉、冻鸡肉、冻猪肉等出口食品样品43份,未检出肠出血性大肠杆菌O157,与PCR-凝胶电泳和分离培养法检测结果一致。结论用金标免疫层析方法检测PCR产物,其灵敏度基本与电泳法相当。初步应用表明PCR-ICT方法简便具有快速、易操作、检测时间短、简便等特点。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

AFLP技术对肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因分型

目的 应用扩增片段长度多态性技术（AFLP）分析肠出血性大肠杆菌O157：H7多态性并对其进行分型。方法 32株肠出血性大肠杆菌O157：H7分离株基因以PstI酶切，将酶切后的基因组DNA与事先合成的人工接头在T4连接酶的作用下连接，然后以此连接了接头的DNA为模板，用与人工接头互补的引物，进行PCR扩增，水平电泳，照相记录结果。结果 共得到16种不同的指纹图谱，经SPSS 10．0聚类分析得到分类树状图。结论 AFLP技术可用于肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因分型，在分子流行病学研究中有较大的应用前景。     

A restaurant-associated outbreak of E. coli O157 infection.

An outbreak of haemorrhagic colitis due to Escherichia coli O157 and associated with a restaurant in Lothian, occurred in September 1990. There were 16 symptomatic cases, four of whom (all children) required dialysis. Notable features of the outbreak were the wide range of incubation periods (1-14 days), the occurrence of secondary spread through asymptomatic carriers and the prolonged period (at least seven days) during which the restaurant appears to have been the source of infection. Despite careful investigation, no single source within the restaurant was identified. The implications for public health are discussed.     

福建省O157大肠杆菌初查

１９９７年４－７月在莆田、福州、霞莆等地区抽抽查部分人群及家养畜禽粪便等，首次在猪、鸭、羊、鸡、鸽等５种动物中检出３种不同类型的Ｏ１５７大肠杆菌，其中Ｏ１５７：Ｈ７与Ｏ１５７：ＮＭ各８株，Ｏ１５７：Ｈ？５株，同时在１位腹泻患儿中分离到此菌。本文不这些Ｏ１５７分离菌株的生物学特性包括形态、生化，致病性以及药物敏感性等进行了实验，发现不同来源、不同类型的Ｏ１５７大肠杆菌都可致使小鼠发病死亡。在防治工作     

方阵式PCR在大肠埃希菌O157检测中的成本效益分析

目的:探讨一种检测O157的经济适用的检测方法。方法:把100个待检样品排成10×10方阵,对方阵中的每排,每列样品混合为一个新的样品,对混合样品进行O157的PCR检测。结果:PCR与方阵相结合,比传统检测方式节省约80%的检测成本,而且能快速准确定位目的菌。结论:PCR与方阵相结合是一种经济有效的检测方法,值得在大样本量的检测工作中推广。     

Quantitative detection of E. coli, E. coli O157 and other shiga toxin producing E. coli in water samples using a culture method combined with real-time PCR

Recent water related outbreaks of shiga toxin producing E. coli O157 have resulted in increased attention of the water industry to this potentially deadly pathogen. Current methods to detect E. coli O157 and its virulence genes are laborious and time-consuming. Specificity, sensitivity and simple use of a real-time PCR method makes it an attractive alternative for the detection of STEC E. coli O157. This study describes the development and application of real-time PCR methods for the detection of E. coli O157, shiga toxin genes (Stx1 and Stx2) and E. coli. The specificity of the methods was confirmed by performing colony-PCR assays on characterized bacterial isolates, demonstrating the applicability of these assays as rapid tests to confirm the presence of E. coli or E. coli O157 colonies on culture plates. Sensitive culture-PCR methods were developed by combining culture enrichment with real-time PCR detection. This rapid method allowed detection of low concentrations of E. coli O157 in the presence of high concentrations of non-O157-E. coli (1:104). Culture-PCR methods were applied to 27 surface water and 4 wastewater samples. E. coli O157 and both Stx genes were detected in two wastewater samples, whereas only E. coli O157 was detected in two surface water samples. Culture-PCR methods were not influenced by matrix effects and also enabled quantitative (MPN) detection of E. coli in these samples.     

福建省O157大肠杆菌调查

目的 探索Ｏ１５７大肠杆菌在福建省人兽及食物中的存在情况,并了解这些检出菌的生物学特性。方法 １９９７～１９９８年选莆田、福州等地检查腹泻患粪便、畜食粪便标本及肉类标本２７２５份,以血清学方法检测Ｏ１５７大肠杆菌。结果 先从猪、鸽、牛、鸡、鸭等动物及腹泻中检出７６株Ｏ１５７大肠杆菌。据血清学及动力试验结果分类,３３株Ｏ１５７：Ｈ７,２１株Ｏ１５７：ＮＭ,２２株Ｏ１５７：Ｈ？,其中以猪检出率最高     

食品样品中大肠杆菌O157:H7复合PCR检测方法的研究

根据大肠杆菌O15 7:H7特异性基因fliC ,rfbE ,SLTI与SLTII设计四对引物 ,建立了复合PCR方法 ,扩增产物长度分别为为 5 6 0bp ,6 78bp ,2 10bp与 4 84bp。该方法可以一步检测出O15 7与H7特异性抗原基因 ,并可同时检测该菌产生SLT毒素的类型 ,与 71株试验菌株的基因型完全配合 ,是一种特异、高效的检测方法。该方法适用于牛奶样品中大肠杆菌O15 7:H7的检测 ,经过增菌步骤检测限可达 0 1cfu ml     

12株疑似O157：H7大肠菌PER鉴定研究

目的：对12株疑似O157：H7大肠菌采用PCR法进行鉴定。方法：利用单一PCR和多重聚合酶链反应（mPCR）检测不同来源菌株志贺样毒素（stx1和stx2）、溶血素（hly）、粘附抹平因子（eaeA）、β-葡糖醛酸糖苷酶（uidA）、O157抗原编码（血E）、H7鞭毛抗原编码（niC）基因。结果：4株大肠菌rfbE和fliC基因检测为阳性，确认为EHEC O157：H7，其中1株菌株扩增出全部毒力基因，另3株菌株扩增出除stx1外其它全部毒力基因；2株大肠菌rfbE基因检测阳性，确认为O157：H7-大肠菌；其它均为非O157：H7其它大肠菌。结论：PCR技术的应用能对可疑O157：117大肠菌进行有效鉴定与分析，应成为今后病原学鉴定的主要技术手段。     

基于功能化纳米粒子的大肠杆菌O157:H7检测技术研究

目的建立一种无需增菌即能快速、灵敏检测大肠杆菌O157:H7的新方法。方法制备一种表面包被大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的纳米级免疫磁颗粒,用于样品中菌体的富集和分离;制备一种表面分别标记有大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和生物素化核酸探针的胶体金颗粒;利用生物素-亲和素-酶系统信号放大作用,达到对目标菌的快速、灵敏检测。结果该方法可在1h内完成菌体的分离和检测,检测限为10cfu/ml。结论该检测体系基于功能化纳米粒子进行菌体分离及信号放大,具有检测时间短、灵敏度高、操作简便等优点,在环境、食品检测,临床诊断和流行病监测中具有广泛的应用前景。