含有WW结构域的氧化还原酶的基因在骨肉瘤组织中表达的临床意义及其对骨肉瘤的调控作用

目的:探讨含有WW结构域的氧化还原酶的基因(WWOX)在骨肉瘤组织中的表达与患者临床病理特征的相关性,研究WWOX在小鼠中对人骨肉瘤生长和转移的影响及其分子机制。方法:收集2011年1月至2018年12月来自郑州大学第一附属医院的骨肉瘤患者112例,采用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨肉瘤组织中...     

全反式维甲酸联合干扰素-β对人骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用

目的 观察全反式维甲酸(ARTA)联合干扰素(IFN)-β对人骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制试验以及对干扰素/维甲酸联合应用诱导凋亡的相关基因19( GRIM-19)和原癌基因信号转导与转录激活因子-3( STAT3)的表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测不同药物浓度的ATRA/IFN-β,单用或联合应用对MG-63的增殖抑制率；流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI法检测MG-63的凋亡；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MG-63中STAT3与GRIM-19基因的扩增情况；Western blot检测MG-63中STAT3与GRIM-19蛋白的表达.结果 ARTA和IFN-β单用或联合应用均可抑制MG-63的增殖,呈浓度依赖性并与作用时间有关；联合应用抑制作用明显增强,与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05).ARTA、IFN-β单独作用,可诱导MG-63凋亡；联合应用时,诱导凋亡作用显著增强.ARTA联合IFN-β作用,GRIM-19 mRNA的表达明显增强(1.620±0.095),GRIM-19蛋白明显升高(1.850±0.060),与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.01).STAT3 mRNA的表达明显降低(0.120 ±0.032),STAT3蛋白明显降低(0.540±0.075),与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 ARTA/IFN-β作用,可明显抑制MG-63的增殖并诱导其凋亡,其机制可能是诱导GRIM-19高表达,特异性结合于STAT3的转录活性区域,使原癌基因STAT3的表达降低.     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

基于ERK5通路探讨蟾酥抑制人骨肉瘤MG-63细胞的作用机制

目的：研究蟾酥对人骨肉瘤细胞MG-63的作用效应及作用机制。方法：体外培养人骨肉瘤细胞MG-63,采用不同浓度的蟾酥含药血清（0%、2.5%、5%）进行干预,采用qPCR法检测各组c-myc、caspase-9的mRNA表达量,采用免疫荧光法检测各组整合素α4的含量并采用Western Blot法检测MEK5、Nur77的表达情况。分别采用ERK5抑制剂XMD8-92、XMD8-92联合5%蟾酥含药血清、MEK5过表达腺病毒干预人骨肉瘤细胞MG-63,采用Western Blot法检测c-myc、caspase-9及整合素α4的表达量。结果：相较于空白对照组（%）,2.5%、5%蟾酥含药血清干预后的c-myc及整合素α4表达下降,caspase-9表达上升（P<0.05）,且蟾酥含药血清干预后MEK5、Nur77表达下降（P <0.05）,与干预浓度呈负相关;相较于5%蟾酥含药血清干预组,XMD8-92联合5%蟾酥含药血清组c-myc及整合素α4表达下降、caspase-9表达上升（P <0.05）,而过表达MEK5联合5%蟾酥含药血清组的表达情况相反（P <0...     

不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系的建立及特征

目的：建立高低不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系并研究其生物学特性。方法：通过体外克隆技术和体内移植，筛选并建立了6个细胞亚系，测量其细胞电泳率，细胞增殖率，利用琼脂克隆形成实验和裸鼠体内成瘤实验，比较各细胞亚系的转移特性。结果：A2、A3、A16亚系的细胞电泳率、细胞增殖率、琼脂克隆形成能力和肺转移灶形成率均明显高于A1、A6、A20亚系。结论：通过体外克隆技术和体内移植的方法可建立不同转移特性的MG-63细胞亚系，有助于骨瘤转移机理的进一步研究。     

不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系的建立及特征

目的:建立高低不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系并研究其生物学特性.方法:通过体外克隆技术和体内移植,筛选并建立了6个细胞亚系,测量其细胞电泳率、细胞增殖率,利用琼脂克隆形成实验和裸鼠体内成瘤实验,比较各细胞亚系的转移特性.结果:A2、A3、A16亚系的细胞电泳率、细胞增殖率、琼脂克隆形成能力和肺转移灶形成率均明显高于A1、A6、A20亚系.结论:通过体外克隆技术和体内移植的方法可建立不同转移特性的MG-63细胞亚系,有助于骨肉瘤转移机理的进一步研究.     

百里醌对人骨肉瘤SaOS-2细胞生长的抑制作用

目的 探讨百里醌对体外人骨肉瘤SaOS-2细胞生长的影响及其机制.方法 百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2细胞24h后,细胞计数CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;DAPI染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化;Western blot检测SaOS-2细胞中Caspase-3、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和Smac的表达.结果 不同浓度(20、40、80μmol/L)百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2细胞24h后,细胞存活率分别为(75.5±4.2)%、(62.1±6.7)%和(52.5±4.9)%;细胞早期凋亡率分别为(8.1±0.7)%、(13.2±1.1)%和(20.2±1.7)%;百里醌作用后,SaOS-2细胞出现典型凋亡的形态学改变;百里醌可明显上调Caspase-3和Smac在SaOS-2细胞中的表达,而显著抑制XIAP的表达.结论 百里醌具有抑制体外人骨肉瘤SaOS-2细胞生长和促进细胞凋亡的作用,可能是通过上调人骨肉瘤SaOS-2细胞中Caspase-3和Smac的表达和下调XIAP的表达而实现.

Abstract：

Objective To investigate the inhibitory effect of thymoquinone on the growth of human osteosarcoma cell line SaOS-2 in vitro.Methods After human osteosarcoma SaOS-2 cells were treated with different concentrations of thymoquinone, the proliferation was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The flowcytometry (FCM) was used to determine apoptosis of SaOS-2 cells. The morphological changes of SaOS-2 cells were observed under the fluorescence microscopy after DAPI staining. Western blotting was used to detect the protein expression of Caspase-3, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and Smac.Results Thymoquinone obviously suppressed proliferation of SaOS-2 cells in a dose-dependent manner, and the apoptosis rate was (8.1±0.7)%, (13.2±1.1)% and (20.2±1.7)% respectively when the concentrations of thymoquinone exposed were 20, 40 and 80 μmol/L. After treatment with thymoquinone, the expression of Caspase-3 and Smac was up-regulated in SaOS-2 cells, and thymoquinone treatment significantly decreased the XIAP levels in SaOS-2 cells.Conclusion Thymoquinone has the anti-tumor effect on the human osteosarcoma SaOS-2 cells in vitroprobably by up-regulating the expression of Caspase-3 and Smac and down-regulating the expression of XIAP.     

三氧化二砷抗人骨肉瘤细胞株MG-63的实验分析

目的:探讨三氧化二砷(Arsenic Trioxide,As2O3)对人成骨肉瘤细胞株MG-63的抑制作用及机制.方法:将MG-63细胞于37℃,5％ CO2等实验条件下传代培养,等细胞进入对数生长期后再进行操作.采用以下实验方法:MTT检测:将MG-63细胞接种于96孔板,测定As2O3对MG-63细胞的半数抑制浓度(IC50),然后测定药物终浓度分别为0、As2O3的IC50、对MG-63细胞的抑制率.结果:MTT法测定As2O3对MG-63细胞的IC50为2.15μmol/ml,IC50浓度的As2O3MG-63细胞的抑制率分别为(52.20±0.19)％结论:低浓度的As2O3抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导凋亡的能力均有明显增强.     

甲氨蝶呤对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及28Livin和Caspase-3表达的影响

目的 观察甲氨蝶呤(MTx)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-3表达的影响.方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞株,用0、50、100、200和400μmol/L的MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24、48、72 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性,用流式细胞仪测细胞的凋亡率,用Western blot检测不同浓度MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后各组细胞的Livin和Caspase-3蛋白表达水平.结果 随MTX浓度增加骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性降低,同时细胞的凋亡率增加(P＜0.05),随MTX浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达降低,Caspase-3蛋白表达增加(P＜0.05).结论 MTX诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与下调Livin表达继而上调Caspase-3表达有关.

Abstract：

Objective To observe the effect of Methotrexate (MTX) on apoptosis and expression of Livin and Caspase-3 in human osteosarcoma cell line MG-63. Methods After treatment of MG-63 cells with MTX at different concentrations (0, 50, 100,200,400 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, methyl thiazol tetrazolium(MTT) assay was used to observe the growth inhibition of MG-63. The apoptosis was assessed by flow cytometry. The protein expression of Livin and Caspase-3 was detected by Western blotting. Results When MTX was added, growth inhibition and increased apoptosis of MG-63 cells were detected,which was showed in a dose- and time-dependent manner. MTX also down-regulated the level of the protein expression of Livin (P＜0.05), and elevated the protein expression of Caspase-3 (P＜0.05). Conclusion MTX can induce apoptosis of MG-63 cells, by down-regulating Livin expression and subsequently up-regulating Caspase-3 expression.     

NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响

[目的]观察NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响.[方法]体外培养人骨肉瘤MG -63细胞系,用50,100,200和400 RmoV L的PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24,48,72 h后,用MTT法测各组骨肉瘤MG-63细胞存活率,用流式细胞仪测细胞的凋亡率.用Western Blot方法检测不同浓度PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后,各组细胞的Livin和Caspase-9蛋白的表达水平.[结果]随PDTC浓度增加,骨肉瘤MG-63细胞后其增殖活性呈下降趋势,作用时间越长细胞的增殖活性越低,而细胞的凋亡率呈上升趋势(P<0.05).随PDTC浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达呈下降趋势,而Caspase9蛋白表达呈上升趋势(P<0.05).[结论]PDTC可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与PDTC抑制NF-kB传导通路,下调Livin表达继而上调Caspase-9表达有关.     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的影响

[目的]研究反义c-myc寡核苷酸(c-mycASODN)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。[方法]设计c-mycASODN片段,将其转入人骨肉瘤MG-63细胞,通过HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪(FCM)分析,观察和分析其对瘤细胞凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白表达的影响。[结果]形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实反义c-myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞从G1期进入S期,即产生G1/S期阻滞,出现明显的凋亡峰,凋亡率达36.82%,并可抑制c-myc基因蛋白的表达。[结论]反义c-myc寡核苷酸可明显诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

熊果酸对人骨肉瘤MG63细胞的影响

目的 探讨熊果酸(UA)对人骨肉瘤MG63细胞的影响作用及其机制.方法 体外培养骨肉瘤MG63细胞,应用浓度为10、20、50、100 μmol/L的熊果酸干预骨肉瘤MG63细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞中骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-6的mRNA的表达,并应用蛋白印记技术检测相应蛋白的表达水平.结果 熊果酸干预组的肿瘤细胞增殖被明显抑制,72 h时100 μmol/L组的增殖活性为(0.25±0.03),而10μmol/L组的增殖活性为(0.86±0.10),差异有统计学意义(P＜0.05),各浓度组在24、48、72 h时的增殖活性差异均有统计学意义(P＜0.05);BMP-2和BMP-6 mRNA和蛋白的表达水平在实验组和对照组间差异均有统计学意义(P＜0.05),而两对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 熊果酸能够抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖,并能够促进细胞中BMP-2和BMP-6的表达.     

Survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株增殖抑制的影响

我们应用化学合成的特异性Survivis-siRNA在脂质体的介导下转染骨肉瘤MG-63细胞，观察其对骨肉瘤细胞增殖抑制的影响。[第一段]     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

Let-7a对人乳腺癌细胞生长的抑制作用及机制

目的探讨let-7a对人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用及机制。方法分别用lipofectami-neTM2000介导的let-7a转染MCF-7细胞株(实验组)和siRNA转染细胞株(阴性对照组),并设空白对照组(脂质体转染组)。使用荧光显微镜观察细胞转染效率;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;半定量RT-PCR法检测IMP-1 mRNA的表达;Western blot法测定转染48 h后IMP-1蛋白的表达水平。结果实验组和阴性对照组的细胞转染效率无明显差别;let-7a组细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组及空白对照组(均为P0.05),且具有时间和浓度依赖性;let-7a组的IMP-1 mRNA表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组(F=220.384,P=0.000);在MCF-7细胞中存在IMP-1蛋白表达,let-7a转染组特异性条带明显弱于两个对照组。结论 let-7a对人乳腺癌MCF-7细胞增殖有抑制作用,其机制可能与抑制IMP-1的基因表达有关。     

Notch1 siRNA对乏氧环境骨肉瘤细胞MG-63增殖及周期的影响

[目的]探讨Notch1 siRNA对乏氧环境人骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和周期的影响。[方法]将骨肉瘤细胞株MG-63细胞置于乏氧(37℃、1%O2、5%CO2)环境下培养作为实验组,以正常氧环境(37℃、21%O2、5%CO2)下培养作为对照组,培养72 h,应用MTT方法检测不同时间乏氧培养对MG-63细胞增殖的影响;采用Notch siRNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,MTT方法检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达变化。[结果]乏氧培养可促进MG-63细胞增殖,48 h常氧及乏氧对细胞增殖的作用可见明显差异(2.164±0.075 vs 1.421±0.086)(P<0.01)。流式细胞分析显示实验组、对照组MG-63细胞培养48 h G1/G2期细胞比例分别为(41.79±3.25)%和(53.87±2.31)%(P<0.05),乏氧可以促进细胞周期进展,Notch1 siRNA有效下调乏氧MG-63细胞Notch1蛋白表达,Notchl siRNA作用48 h后乏氧环境MG-63细胞周期阻滞于G1/G2期。Western-blot结果显示乏氧环境下MG-63细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达增高。[结论]乏氧环境能通过促进MG-63细胞周期进展,从而明显促进细胞增殖,阻断Notch可逆转乏氧对MG-63细胞促增殖作用,提示Notchl是治疗骨肉瘤的有效分子靶点。     

Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用

我们以骨肉瘤OS 73 2细胞为对象 ,在明确其高表达Survivin基础上 ,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS 73 2细胞 ,以封闭Sur vivin表达 ,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡 /增殖的影响及其对化疗药物的促进作用。一、材料与方法1.材料 :人骨肉瘤细胞株OS 73 2购自北京积水潭医院骨科研究所。针对Survivin基因翻译起始密码区 ,设计合成ASODN (上海生工公司 ) ,序列为 5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′ ,并设正义 (senseoligonucleotide ,SODN )对照 ,序列为 5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC3′ ,两组寡核苷酸均…     

噻莱昔布(celecoxib)对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响

目的:研究环氧化酶2(cyclooxygenase2,COX2)抑制剂celecoxib对人骨肉瘤细胞MG63抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法:MTT比色观察celecoxib的细胞毒性作用及其浓度依赖性;Hoechst33258荧光染色、透射电子显微镜和TUNEL观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及其时间依赖性。结果:celecoxib分别以10、20、40、80μmol/L作用后,细胞生长受到不同程度抑制;荧光显微镜、电镜和TUNEL观察到细胞胞浆浓缩、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成。流式细胞仪显示celecoxib40μmol/L作用24、48、72h后,细胞凋亡率分别与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)。结论:celecoxib能抑制人MG63细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

miR-27b对骨肉瘤MG63细胞生长的影响及其机制探讨

目的 探讨miR-27b对骨肉瘤MG63细胞生长的影响及其机制.方法 将体外培养的MG63细胞分为模拟物对照组、miR-27b模拟物组、抑制剂对照组和miR-27b抑制剂组,采用RT-PCR检测各组细胞中miR-27b的表达,MTT法检测细胞增殖活性,Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移,流式细胞仪检测细胞凋亡....     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.