TAB1——基于蛋白质组学的卵巢癌紫杉醇耐药的潜在生物标志物探讨

目的:探究卵巢癌对紫杉醇(PTX)耐药的潜在靶点及其相关机制。方法:体外培养卵巢癌A2780细胞和A2780PTX耐药细胞(A2780/T),采用不同浓度(2,4,8,16,32,64,128,256μmol·L^-1)PTX分别干预24 h或48 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测PTX对A2780细胞和A2780/T细胞存活率的影响,利用液相色谱质谱/质谱(LC-MS/MS)非标记(Label-Free)定量蛋白质组学方法鉴定和筛选两组细胞中表达差异的蛋白,通过基因本体(GO)注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,筛选卵巢癌细胞对PTX耐药的潜在生物标志物。以正常培养的A2780细胞作为空白组,采用0,1,4μmol·L^-1的PTX处理A2780/T细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测验证潜在靶点转化生长因子-β活化激酶1结合蛋白1(TAB1)及其下游相关分子转化生长因子-β活化激酶1(TAK1),p38有丝分裂活化蛋白酶(MAPK)mRNA和蛋白的表达水平。结果:与空白组比较,PTX干预组的A2780和A2780/T细胞的活力均降低。PTX对A2780细胞的抑制率明显高于A2780/T细胞。A2780细胞中,PTX处理48 h的半抑制浓度(IC50)为0.002μmol·L^-1,A2780/T细胞中,PTX的IC50>设置的最高浓度128μmol·L^-1,与A2780细胞相比,A2780/T细胞对PTX具有耐药性。通过非标记定量蛋白质组学分析筛选出A2780/T和A2780细胞之间有441种差异表达蛋白和421种特殊差异表达蛋白。GO功能富集分析显示,在差异表达的蛋白质中,结合蛋白占大多数(80%)。根据KEGG通路分析结果和表达位点分析,TAB1被认为可能是卵巢癌对PTX耐药的潜在生物标志物。与A2780细胞比较,A2780/T细胞的TAB1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),与TAB1相互作用的TAK1 mRNA和p38 MAPK mRNA亦明显降低(P<0.05,P<0.01),但蛋白表达无显著变化。结论:TAB1可能是卵巢癌对PTX耐药的潜在生物标志物,其机制可能与TAB1/TAK1/p38 MAPK通路有关。     

血根碱对紫杉醇耐药卵巢癌 A2780/Taxol细胞生长及TGF-β1/Smad通路抑制的影响

目的探讨血根碱对紫杉醇耐药卵巢癌A2780/Taxol细胞生长及TGF-β_1/Smad通路和紫杉醇敏感性的影响。方法将A2780/Taxol细胞分为对照组、血根碱组、紫杉醇组、血根碱联合紫杉醇组(简称联合组),对照组加生理盐水,其余3组分别应用2μmol/L血根碱、2μg/mL紫杉醇,2μmol/L血根碱+2μg/mL紫杉醇处理。48 h后应用倒置显微镜观察A2780/Taxol细胞形态、MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测Caspase-3、TGF-β_1、Smad7蛋白表达。结果对照组细胞贴壁生长,边界清楚;血根碱组细胞体积缩小,贴壁数减少;紫杉醇组见细胞呈圆形脱落;联合组上过变化最为明显。与对照组比较,3组均可显著抑制A2780/Taxol细胞增殖,上调Caspase-3、Smad7蛋白表达、下调TGF-β_1蛋白表达,联合组作用最为明显(P0.05)。血根碱组对细胞周期无影响,紫杉醇组及联合组G0/G1期、S期细胞减少,G2/M期细胞增多。结论血根碱通过抑制TGF-β_1/Smad通路,促进Caspase-3表达抑制A2780/Taxol细胞生长,促进紫杉醇药物敏感性。     

β-榄香烯联合高温对肺腺癌A549细胞作用的实验研究

目的:观察榄香烯联合高温对人肺腺癌A549细胞的协同杀伤作用。方法:用MTT法检测高温处理或常温处理细胞对榄香烯的敏感性。采用15μg/mL榄香烯或60μg/mL榄香烯联合42℃高温处理1.5h或常温处理,使用流式细胞仪检测细胞周期,透射电镜观察细胞形态学改变。结果:高温作用后,榄香烯对A549细胞的IC50从35.43μg/mL降低至28.68μg/mL;MTT法检测显示低浓度榄香烯联合高温对A549细胞具有明显的协同杀伤作用,细胞呈现凋亡形态,可见凋亡小体,同时有细胞坏死。结论:低浓度榄香烯联合高温对A549细胞有协同细胞毒效应。     

红参中人参总皂苷联合雷公藤红素体内外抗卵巢癌作用评价

目的评价红参中人参总皂苷联合雷公藤红素体内外抗卵巢癌作用及优势。方法采用HPLC法测定来自红参的人参总皂苷中主要单体的含有量;体外采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和膜联蛋白V-PE/7-氨基放线菌素D(Annexin V-PE/7-AAD)流式细胞仪法检测人参总皂苷、雷公藤红素、人参总皂苷+雷公藤红素对人源卵巢癌细胞SKOV-3和HO-8910生长及凋亡诱导的影响;体内通过建立裸鼠SKOV-3卵巢癌皮下移植模型,对人参总皂苷、雷公藤红素、人参总皂苷+雷公藤红素的抑瘤率、相关安全性及荷瘤小鼠生存时间进行评价。结果人参总皂苷中人参皂苷Rg1含有量为10.04%,人参皂苷Re为5.30%,人参皂苷Rb1为9.62%。人参总皂苷、雷公藤红素、人参总皂苷+雷公藤红素对SKOV-3的IC50分别为(184.57±14.93)、(9.32±1.18)、(2.54±0.32)μg/m L;对HO-8910的IC50分别为(316.82±27.61)、(36.87±2.34)、(21.47±1.96)μg/m L。人参总皂苷+雷公藤红素(10μg/m L+50μg/m L)可以诱导(52.1±3.5)%的SKOV-3细胞和(27.1±2.5)%的HO-8910细胞凋亡。人参总皂苷+雷公藤红素对荷SKOV-3卵巢癌裸鼠的抑瘤率为(76.67±5.93)%,中位生存时间为38 d,实验观察期内荷瘤裸鼠体质量、肝指数和脾指数没有显著性变化,血清中TNF-α和IL-6的水平显著升高。结论人参总皂苷联合雷公藤红素在体内外均有明显抗卵巢癌作用,并且两药联用优于单药使用。     

β-榄香烯联合吉非替尼对肺癌细胞A549肿瘤干性的影响

目的探讨β-榄香烯联合吉非替尼对肺癌细胞A549肿瘤干性的影响。方法采用MTS法检测β-榄香烯联合吉非替尼对肺癌细胞活性的作用;Transwell检测细胞侵袭能力;细胞划痕检测细胞迁移能力;流式细胞检测细胞凋亡、细胞周期;Western blot检测上皮-间质转化相关标记分子(E-Cadherin、N-Cadherin、ZEB1、Vimentin)。结果榄香烯浓度在0～50μmol/L内对肺癌细胞(A549、H522、H1299、PC-9)活性无显著影响。与对照组比较,β-榄香烯(40μg/mL)联合吉非替尼(5μmol/L)能显著抑制A549细胞活性(P0.01);降低S期细胞比例(P0.05),但不影响A548细胞凋亡,抑制A549细胞的侵袭与转移(P0.05,P0.01),上调E-Cadherin蛋白表达,下调N-Cadherin、ZEB1、Vimentin蛋白表达(P0.01)。结论榄香烯(≥50μmol/L)能抑制肺癌细胞增殖,呈剂量依赖;β-榄香烯(40μg/mL)联合吉非替尼抑制肺癌细胞的侵袭、转移及上皮-间质转化(EMT)。     

鸦胆子油乳对人卵巢癌耐药细胞A2780／DDP的耐药逆转作用

目的 研究鸦胆子油乳对人卵巢癌耐药细胞A2780/DDP的耐药逆转作用.方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察顺铂及鸦胆子油乳对A2780/DDP细胞的生长抑制作用.结果 卵巢癌耐药细胞株A2780/DDP对顺铂产牛耐药性,顺铂对A2780/DDP的耐药倍数为5.6倍.经鸦胆子油乳预处理24h后,顺铂对A2780/DDP的耐药倍数显著下降.结论 鸦胆子油乳可逆转卵巢癌耐药细胞A2780/DDP的耐药性.     

人参皂苷Rg1对原代培养心肌细胞缺氧复氧损伤的作用

目的探讨人参皂苷Rg1对原代培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的作用及其是否能直接抑制线粒体通透性转换孔的开放。方法原代培养大鼠乳鼠心肌细胞,构建缺氧复氧损伤(H/R)模型,应用不同浓度人参皂苷Rg1进行干预,通过检测细胞活力、线粒体膜电位、细胞色素C的释放,观察人参皂苷Rg1对心肌细胞H/R损伤的作用;将不同浓度的人参皂苷Rg1分别和线粒体25℃孵育10 min,加入200μmol/L CaCl_2诱发mPTP的开放,以1μmol/L的mPTP特异性抑制剂环孢素A(Cs A)为阳性对照,每间隔30 s观察520 nm处吸光度的变化,连续观察10 min,以线粒体肿胀程度评估mPTP的开放情况。结果人参皂苷Rg1能增强H/R损伤后心肌细胞活力,阻止H/R引起的线粒体膜电位的降低,减少细胞色素C释放;6.25,25,100,400μmol/L人参皂苷Rg1无直接抑制mPTP开放的作用。结论人参皂苷Rg1可减轻心肌细胞H/R损伤,保护心肌细胞,其作用与直接抑制mPTP开放无关。     

榄香烯注射液对吉非替尼在PC-9/GR细胞内转运动力学影响

目的研究榄香烯注射液对吉非替尼(GEF)在PC-9/GR细胞内转运动力学影响,探讨该药在逆转肿瘤多药耐药方面的作用。方法活体生物发光技术实时监测PC-9/GR~(Fluc)细胞内ABC耐药蛋白底物D-荧光素钾动力学行为。采用MTT法测定PC-9/GR细胞的耐药性,榄香烯、GEF单用药及联合用药时的细胞毒性,Compusyn软件分析两药联合是否具有协同作用。运用HPLC法,测定联合用药组及GEF单用药组药物在PC-9/GR细胞中的摄取量。结果榄香烯能显著增加细胞内D-荧光素钾的荧光响应强度。吉非替尼对PC-9及PC-9/GR细胞的IC50值分别为0.01、1.50μg/m L,耐药倍数为150倍。所有联合药物组的联合用药指数(combination index,CI)值都小于1,表明两药联合具有较好的协同作用。细胞摄取结果表明,配伍榄香烯(ELE)后,GEF在PC-9/GR细胞摄取明显增加(P0.05)。结论榄香烯增加D-荧光素钾荧光响应强度,促进细胞对GEF摄取,说明在一定程度上能抑制耐药蛋白的外排功能从而逆转耐药。     

通关藤中4种C21甾体化合物逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药的作用评价

目的 评价通关藤中4种C₂₁甾体化合物(通关藤苷I、通关藤苷G、通关藤苷H和17β-通关藤苷元B)对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol(A2780/T)耐药的逆转作用及相关机制。方法 将人卵巢癌A2780/T细胞分为对照组、C₂₁甾体单用组、紫杉醇单用组、C₂₁甾体联合紫杉醇组(1:1),MTT法检测细胞增殖能力,中效原理分析两药联用效应(Fa)与合用指数(CI)的关系;划痕实验观察细胞迁移能力;流式细胞术及Hoechst 33258染色检测细胞周期和凋亡情况;RT-PCR、Western blot法分别检测ABCB1、SLC4A2、SLCO1A2 mRNA及P-gp表达水平;药物外排实验检测A2780/T细胞内紫杉醇及罗丹明123的蓄积量。结果 4种C₂₁甾体单用或与紫杉醇联用均能抑制A2780/T细胞增殖,且呈剂量依赖效应。通关藤苷G、通关藤苷H与紫杉醇联用48 h具有协同效应,能够显著抑制A2780/T细胞迁移、阻滞细胞于G2/M期、促进细胞凋亡,显著抑制ABCB1、SLC4A2、SLCO1A2 mRNA水平,下调P-gp表达,显著促进了紫杉醇及罗丹明123在A2780/T细胞内的蓄积。结论 通关藤苷G、通关藤苷H与紫杉醇联用均产生协同效应,可逆转人卵巢癌A2780/T细胞对紫杉醇的耐药性,其机制可能与降低基因ABCB1、SLC4A2、SLCO1A2及P-gp的表达水平,促进紫杉醇在A2780/T细胞内蓄积有关。     

UPLC-MS/MS法同时测定康艾注射液中11种成分

目的建立UPLC-MS/MS法同时测定康艾注射液中11种成分(毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、芒柄花素、黄芪甲苷、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1)的方法。方法采用正负离子切换多反应监测模式(MRM),ESI离子源;Phenomenex C18色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6μm)进行分离,流动相为甲醇(A)、乙腈(B)、5 mmol/L乙酸铵-0.05 mmol/L乙酸钠水溶液(C),梯度洗脱,分析时间为7.0 min。结果所测11种主要有效成分在测定浓度范围内线性关系良好,r均大于0.99;精密度、重复性和稳定性良好;平均加样回收率为95.2%~104.4%,RSD≤4.64%。4个批次康艾注射液中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、芒柄花素、黄芪甲苷、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1测得量分别为0.004~0.006μg/m L、0.002~0.003μg/m L、125.75~148.00μg/m L、51.75~77.00μg/m L、0.010~0.013μg/m L、51.50~87.75μg/m L、27.83~30.73μg/m L、4.23~5.15μg/m L、8.40~13.35μg/m L、17.33~27.68μg/m L和9.03~11.00μg/m L。结论首次建立可同时测定康艾注射液的11种主要成分的UPLC-MS/MS方法,该法操作简便,灵敏度高,专属性好,分析速度快,可用于康艾注射液的质量控制。