牛磺熊脱氧胆酸对棕榈酸诱导的INS-1细胞凋亡的保护作用

目的:探讨牛磺熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)对棕榈酸(palmitate)诱导的INS-1细胞凋亡的保护作用?方法:分别用不同浓度棕榈酸(0.25?0.50?1.00 mmol/L)?棕榈酸(0.50 mmol/L)加TUDCA(100 μmol/L)培养INS-1细胞24 h,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞早期凋亡,Western blot检测内质网应激相关蛋白GRP78的表达?结果:与对照组相比,棕榈酸组(浓度≥0.5 mmol/L)的INS-1细胞凋亡率显著上升(P < 0.05);加TUDCA培养24 h以后,与棕榈酸组相比,INS-1细胞凋亡率显著下降(P < 0.05)?此外,棕榈酸组(0.5 mmol/L)INS-1细胞内质网应激相关蛋白GRP78的表达显著上升(P < 0.05);加TUDCA培养24 h以后,与棕榈酸组相比,INS-1细胞GRP78蛋白表达显著下降(P < 0.05)?结论:TUDCA能够减少游离脂肪酸引起的INS-l细胞凋亡,对INS-1细胞发挥保护作用?而减少内质网应激蛋白的表达,缓解内质网应激可能是其作用机制之一?     

大麻二酚通过促进自噬流减轻棕榈酸诱导的肝细胞损伤

目的 观察大麻二酚(CBD)对棕榈酸(PA)诱导的肝细胞损伤的保护作用,并考察其与自噬流相关的潜在机制.方法 原代培养大鼠肝细胞,分别给予1 μmol/L和5μmol/L的CBD处理24 h,采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和p62的表达,考察CBD对细胞自噬的影响.将细胞分为4组并分别给予不同处理:PA组(800μmol/L PA处理细胞)、PA+CBD组(800 μmol/L PA和5μmol/L CBD联合作用)、PA+CBD+CQ组[800 μmol/L PA、5μmol/L CBD和50 nmol/L自噬抑制剂氯喹(CQ)共同作用]和阴性对照组(加入等体积0.03％ DMSO处理细胞),每组作用时间均为24 h;采用蛋白质印迹法检测LC3和p62的蛋白表达,流式细胞术考察细胞凋亡情况,qPCR法检测内质网应激相关因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和X盒结合蛋白1(XBP-1) mRNA的表达,Rh123和lucigenin荧光探针分别检测线粒体的膜电位和活性氧簇(ROS)含量.结果 1μmol/L和5μmol/L CBD均不影响肝细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值以及p62蛋白的表达.与阴性对照组相比,PA组肝细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和p62蛋白表达增加(P＜0.05),细胞凋亡增加(P＜0.05),CHOP、GRP78、XBP-1 mRNA表达增加(P＜0.05),线粒体膜电位降低(P＜0.05),线粒体ROS的生成增加(P＜0.05);与PA组相比,PA+CBD组肝细胞内的自噬流恢复,细胞凋亡减少,内质网应激和线粒体失常减轻(P＜0.05);同时给予CQ处理可以逆转CBD的保护作用(P＜0.05).结论 CBD能够通过促进自噬流减轻PA诱导的肝细胞损伤,改善内质网应激和线粒体功能.     

丹参酮ⅡA减轻棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激

[目的]探讨丹参酮ⅡA对棕榈酸诱导心肌细胞脂毒性损伤模型内质网应激凋亡的影响.[方法]将对数期H9c2细胞分6组,即对照组,棕榈酸(400μmol/L)组,丹参酮ⅡA 20μmol/L组和棕榈酸+丹参酮ⅡA(5、10、20μmol/L)组,另外引入棕榈酸+CCT020312组与棕榈酸+CCT020312+丹参酮ⅡA 2...     

内质网应激通路在棕榈酸诱导的人牙周膜干细胞凋亡中的作用

目的 探讨内质网应激通路在棕榈酸(PA)诱导的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)凋亡中的作用机制.方法 将培养的hPDLSCs随机分为对照组(不含PA的培养基),PA低、中、高浓度(0.1、0.2、0.4 mmol/L)组以探究PA抑制hPDLSCs增殖的作用机制;将培养的hPDLSCs分为对照组(不含PA的培养基)、P...     

ROS介导棕榈酸诱导的肾小球足细胞骨架及裂孔隔膜损伤

目的：探讨棕榈酸（palmitic acid,PA）对足细胞肌动蛋白纤维骨架及裂孔隔膜蛋白损伤的影响。方法：应用PA刺激体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株,分为对照组（1% BSA）和PA（150 ?滋mol/L）组。采用Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;免疫荧光染色法观察检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达;油红“O”、透射电镜以及BODIPY染色检测PA刺激下足细胞内脂质积聚情况。应用不同浓度PA刺激足细胞,分为对照组（1% BSA）、50 ?滋mol/L PA组、150 ?滋mol/L PA组、300 ?滋mol/L PA组。采用Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。进一步应用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）预处理足细胞,分为对照组（1% BSA）、PA（150 ?滋mol/L）组、NAC组、PA（150 ?滋mol/L）+ NAC组。采用DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生;Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。结果：Western blot结果示300 ?滋mol/L PA组足细胞内Nephrin和Podocin 的表达（0.360±0.030,0.900±0.040）分别与对照（Ctr）组（1.000±0.030,1.000±0.030）和50 ?滋mol/L PA组（0.912±0.020,0.900±0.040）相比都明显减少（P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.003）。免疫荧光显示与Ctr组相比,PA组足细胞Nephrin（t=6.014,P=0.010）和Podocin（t=6.171,P=0.010）蛋白的表达减少。使用NAC预处理足细胞清除ROS,与PA组（1.21±0.04,1.30±0.03）相比,PA+NAC组Nephrin（2.87±0.05）和Podocin（2.69±0.06）的表达减少（P=0.000,P=0.000）。结论：ROS介导了棕榈酸诱导的足细胞骨架及裂孔隔膜损伤。     

棕榈酸诱导大鼠主动脉内皮细胞凋亡

目的研究棕榈酸对大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响。方法 0.5%BSA或0.5%BSA及不同浓度的棕榈酸(0.1、0.2和0.3 m m)作用于大鼠主动脉内皮细胞24 h,M TT法检测细胞活性,流式细胞仪AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡,分光光度计检测C aspase-3活性。结果 M TT检测结果提示棕榈酸组较对照组细胞活性下降;AnnexinⅤ/PI法检测结果提示棕榈酸组较对照组细胞凋亡增加(P<0.05或P<0.01)。棕榈酸组较对照组C aspase-3活性增加(P<0.05或P<0.01)。结论棕榈酸能够诱导内皮细胞凋亡,说明高水平的游离脂肪酸对内皮细胞有直接的伤害作用。     

大黄酸通过非活性氧依赖性内质网应激通路诱导L-02细胞凋亡

研究大黄酸对人正常肝细胞L-02的凋亡作用及探讨其机制。应用MTT法评价大黄酸对L-02细胞的活性抑制作用;流式细胞术检测大黄酸诱导L-02细胞的凋亡;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)含量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技术检测细胞内质网应激相关基因和蛋白的表达变化;并探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对内质网应激蛋白及caspase-4、caspase-3的影响。实验结果显示:大黄酸能够呈剂量和时间依赖性抑制L-02细胞活性,增加L-02细胞凋亡率;诱导细胞ROS水平增高,NAC预给药可显著降低其水平;大黄酸能显著上调L-02细胞内的葡萄糖调节蛋白78(GRP 78)、活化转录因子4(ATF-4)和C/EBP同源蛋白(CHOP)基因的mRNA水平;显著增加GRP 78,磷酸化c-jun 氨基末端激酶(p-JNK),CHOP蛋白表达;NAC不能抑制大黄酸诱导的GRP 78,p-JNK,CHOP蛋白表达上调,亦不能抑制大黄酸诱导的caspase-4及caspase-3活性增加。表明大黄酸能够诱导L-02细胞凋亡,其作用机制与非活性氧依赖性的内质网应激通路有关。     

ATF4通过调控HKDC1对肝癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的 探讨转录活化因子4(ATF4)对肝癌细胞(HCC)增殖、迁移、凋亡的影响及其作用机制.方法 通过RNA干扰技术下调HepG2和Huh7细胞中ATF4和己糖激酶结构域成分1(HKDC1)的蛋白表达;分别用CCK-8法、克隆形成实验、划痕实验及流式细胞术检测转染后的HCC增殖、迁移及凋亡的变化,用Western bl...     

新藤黄酸通过内质网应激诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的研究

目的研究新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的机制。方法采用不同浓度的GNA作用细胞24h,对照组是相同浓度GNA加内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)共同作用HCT116细胞24h。采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)染色测定两组细胞增殖抑制率的差异,采用吖啶橙(acridine orange,AO)和溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色观察细胞的形态学变化,采用膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ,AV)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙碇(propidium iodide,PI)双重染色检测细胞凋亡率。结果内质网应激抑制剂4-PBA可以缓解GNA对HCT116细胞增殖的抑制作用;AO/EB染色后荧光显微镜观察发现GNA作用的细胞具有凋亡特征;流式细胞仪检测显示4-PBA可降低HCT116细胞的凋亡率。结论 GNA能抑制人结肠癌细胞HCT116增殖,诱导细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的作用可能与内质网应激途径有关。     

ATF4在顺铂致肝癌细胞HepG2凋亡中的作用

目的 探讨ATF4在顺铂诱导的肝癌细胞HepG2凋亡中的变化,并对其作用进行初步研究.方法 人肝癌细胞HepG2经不同浓度顺铂处理24和48 h后,MTS法检测细胞活力;Western blot 检测内质网应激反应及凋亡相关蛋白(Bip、 ATF4、PARP、activated-Caspase3、CHOP)表达的变化;使用siRNA干扰技术沉默ATF4 的表达,并观察沉默ATF4蛋白表达后,肝癌细胞对顺铂敏感性的变化;利用Annexin V-FITC 和PI双标法,在倒置荧光显微镜中检测细胞凋亡情况.平板克隆形成实验用于判断单个细胞克隆生长速度.结果 与溶剂对照组相比,顺铂明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡;时间和浓度依赖性地引起内质网应激反应相关蛋白CHOP、ATF4表达水平上调,但不影响Bip的蛋白表达;同时导致activated-Caspase3的活化,引起PARP蛋白的切割. 使用siRNA沉默ATF4的蛋白表达后,能部分逆转顺铂引起的细胞凋亡以及克隆形成抑制.结论 顺铂可以通过上调ATF4的表达,触发内质网反应,从而诱导肝癌细胞凋亡.     

NFAT2参与高糖诱导的大鼠足细胞凋亡

目的探讨高糖在体外培养足细胞中是否激活NFAT2并导致足细胞凋亡,并探讨其发生机制。方法大鼠足细胞分别在不 同的培养液中（葡萄糖5.3、10、20、30 和40 mmol/L,葡萄糖5.3 mmol/L+Mannitol 14.7 mmol/L,葡萄糖20 mmol/L+11R-vivit 100 nmol/L,葡萄糖20 mmol/L+CsA 500 nmol/L）培养不同的时间（0.5、1、2、4、12、24和48 h）;分别用免疫荧光、Western blot检 测NFAT 2的活化;流式细胞术检测足细胞的凋亡,实时定量PCR和Western blot检测Bax表达;用激光共聚焦动态观察足细胞 内Ca2+水平的变化。结果不同葡萄糖浓度培养的足细胞,足细胞核中NFAT2/Histone3 的比值分别为0.999±0.001;1.652± 0.188;2.405±0.281;1.850±0.397 及2.000±0.381,葡萄糖20 mmol/L（HG）分别作用足细胞0.5、1、2 和4 h,Western blot 显示 NFAT2/Histone 3结果分别为：1.253±0.332、1.656±0.464、2.080±0.319及1.601±0.431,培养2 h时NFAT2的活化达到高峰;经过 CsA或者11R-VIVIT预处理后可见完全阻断NFAT2的核积累,也阻断细胞凋亡;同时,我们发现高糖可增加体外培养足细胞的 钙离子内流,导致NFAT2的核积累和Bax表达。结论高糖可能通过CaN/NFAT2/Bax信号通路介导足细胞的凋亡,阻断CaN/ NFAT2/Bax信号通路可以减少高糖诱导的足细胞凋亡。     

阻断PI3K/AKT通路抑制棕榈酸诱导的肝癌细胞凋亡

目的:探讨三磷酸酰肌醇蛋白激酶(PI3K)信号通路与棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导肝癌细胞凋亡的关系.方法:培养人肝癌细胞系PLC、SMMC-7721及LM3,经PA及三磷酸酰肌醇蛋白激酶(Phosphotidylinsitol-3-Kinase,PI3K)抑制剂LY294002处理细胞后,利用倒置相差显微镜观察细胞形态;通过Western blotting分析阻断PI3K/AKT信号通路与PA诱导PLC、SMMC-7721及LM3细胞凋亡之间的关系.结果:PA处理明显诱导PLC、SMMC-7721及LM3细胞发生凋亡;阻断PI3K/AKT信号通路抑制了PA对上述肝癌细胞凋亡的诱导.结论:阻断PI3K/AKT信号通路可抑制PA诱导的肝癌细胞凋亡.     

水飞蓟素通过抑制心肌细胞凋亡减轻心肌梗死

目的：观察水飞蓟素对心肌梗死小鼠的血流动力学、梗死面积及梗死边缘区凋亡蛋白表达情况。方法：将60只小鼠随机分为心肌梗死组、假手术组、心肌梗死+水飞蓟素组和心肌梗死溶剂组。建模成功4周后检测小鼠血流动力学变化,进行心脏超声检查,评价梗死面积、细胞凋亡指数以及凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3的表达。结果：与心肌梗死组小鼠相比,水飞蓟素可显著减轻心肌梗死,改善心梗小鼠心功能,降低心肌细胞凋亡指数,增强Bcl-2蛋白表达和减弱Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达。结论：水飞蓟素能够减轻心肌梗死,改善心梗小鼠心室收缩功能,保护心肌,减少心肌细胞的凋亡,其机制与升高Bcl-2蛋白、降低Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达水平有关。     

高糖环境对肾小球足细胞及TNFR1的影响

目的:探究高糖环境下小鼠肾小球足细胞及炎症因子TNFR1的改变,期望为糖尿病肾病(DN)的防治提供新的思路。方法:将离体培养的小鼠肾小球足细胞分别设为正常对照组(D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高渗组(D-葡萄糖5.5 mmol/L+甘露醇39.5 mmol/L)、高糖组(D-葡萄糖45 mmol/L)。刺激48 h后,用western blotting检测高渗组、高糖组足细胞胰岛素信号通路的关键蛋白、纤维化标志蛋白、炎症水平的变化,以及炎症因子TNFR1的表达情况;刺激72 h后,观察高糖组足细胞形态及细胞核的变化。结果:刺激48 h后,pIRS-1~(Ser307)在高渗组和高糖组表达均高于正常组,pAKT~(Ser473)在高糖组表达低于正常组,足细胞胰岛素抵抗水平上升; CollagenⅠ、Fibronectin及IL1β在高渗组和高糖组表达均高于正常组,足细胞纤维化水平及炎症水平上升;此外,炎症因子TNFR1在高渗组和高糖组表达也高于正常组。刺激延长至72 h,与正常对照组比较,高糖组足细胞形态发生改变并开始出现凋亡。结论:高糖可影响足细胞的形态及生存,提高足细胞炎症水平。甘露醇和高糖均促进炎症因子TNFR1的表达,推测DN伴随的高渗、高糖均可影响TNFR1在足细胞的表达。TNFR1可能成为DN防治的新靶点。     

黄芩汤通过调节ILC3s-Th细胞反应减轻小鼠的溃疡性结肠炎

目的探讨黄芩汤在治疗溃疡性结肠炎（UC）过程中对三型固有淋巴细胞（ILC3）及辅助性T细胞（Th）免疫反应的调控作用。方法将雄性Balb/c小鼠随机分为6组：正常组、模型组、美沙拉嗪组、黄芩汤低、中、高剂量组（HL，2.275 g/kg；HM，4.55 g/kg；HH，9.1 g/kg）。各组自由饮食，除正常组自由饮用蒸馏水外，其余各组小鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠溶液，持续7d以建立UC模型，同时美沙拉嗪组和黄芩汤低、中、高剂量组小鼠每日分别给予美沙拉嗪及低、中、高剂量黄芩汤灌胃1次。流式细胞术分析结肠固有层淋巴细胞中ILC3s细胞比例及其表面主要组织相容性复合物Ⅱ类（MHCⅡ）分子表达变化以及Th细胞中Th1与调节性T细胞（Treg）的比例变化。采用Milliplex多因子测定方法检测结肠组织中多个细胞因子含量的变化。结果与模型组相比，黄芩汤各剂量组小鼠溃疡性结肠炎症状得以缓解，疾病活动指数评分及宏观评分下降（P < 0.001）。流式细胞术结果表明，黄芩汤各剂量组小鼠结肠中ILC3s细胞比例增加（P < 0.05）且MHCⅡ分子表达增多（P < 0.05），其中黄芩汤低、中剂量组Th1细胞比例降低（P < 0.05）而Treg细胞比例增加（P < 0.05）。Milliplex多因子测定结果表明，黄芩汤各剂量组小鼠结肠组织中Th细胞相关的促炎性细胞因子如白介素-2、白介素-17A、白介素-23、α肿瘤坏死因子、γ干扰素含量降低（P < 0.05）。结论黄芩汤通过增加ILC3s细胞数目及其MHCⅡ的表达，调节Th细胞免疫反应，从而缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。     

姜黄素通过调节肠道IEL亚群缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎

目的 观察传统中药成分姜黄素对葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium,DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的炎症状况及IEL亚群的影响,探讨姜黄素对治疗溃疡性结肠炎的可能机制.方法 选取成年雄性C57BL/6小鼠60只,按照随机数字表法分为3组,每组20只,分别为正常组、DSS组和DSS+姜黄素组,通过对小鼠疾病活动程度指数(disease activity index,DAI)评分及结肠组织HE染色评估炎症状况,应用流式细胞术分析各组结肠IEL亚群.结果 与正常组对比,DSS组DAI评分明显升高(P＜0.01);结肠黏膜损伤程度明显加重;CD8αd和TCRγδ亚群比例降低(P＜0.01),CD4亚群比例升高(P＜0.05).而与DSS组比较,DSS+姜黄素组DAI评分明显降低(P＜0.05);结肠黏膜损伤程度明显减轻;CD8αα和TCRγδ亚群比例升高(P ＜0.01);CD4亚群比例降低(P＜0.05).结论 姜黄素缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎可能通过调节IEL亚群变化.     

大鼠足细胞的原代培养及其Nephrin的特异表达

目的 建立简便的大鼠足细胞原代培养体系,检测其去氧肾上腺素(Nephrin) mRNA及蛋白的表达水平.方法 无菌取肾,分离肾皮质,胶原酶消化法分离肾小球,培养9～10d,胰蛋白酶差异消化法传代,过筛去除肾小球继续培养5～7 d:形态学观察和间接免疫荧光法进行足细胞鉴定;流式细胞仪分析足细胞纯度;实时定量PCR(qRT-PCR)、间接免疫荧光法和Western blot法比较前三代足细胞中Nephrin mRNA及蛋白的表达水平.结果 接种5d后大部分肾小球贴壁,肾小球周围有细胞爬出,其最外缘有树枝状细胞分布,形态学及特异性抗体Nephrin、WT-1鉴定为足细胞;流式细胞仪分析足细胞纯度为94.7％;间接免疫荧光和qRT-PCR均显示:与第二、三代足细胞相比,第一代足细胞中Nephrin mRNA和蛋白表达均较高(均P＜0.05);Western blot示体外培养大鼠足细胞表达两种分子量的Nephrin,且第一代足细胞Nephrin灰度值高于第二、三代足细胞(P＜0.05).结论 酶消化法结合差异过筛法接种可促进肾小球贴壁,有利于培养纯度高的足细胞;大鼠足细胞体外培养条件下能特异性表达Nephrin结构及功能蛋白.     

褐藻多糖硫酸酯对组织蛋白酶B活性影响的实验研究

目的研究褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)对氧化应激损伤及溶酶体组织蛋白酶B活性的影响,探讨Fucoidan用于中枢神经系统疾病的作用机制。方法 50μg.L-1神经生长因子(nerve growth factor,NGF)分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞(differentiated PC12,dPC12)7 d,0.5 mmol/L H2O2刺激30 min,给予10 mg.L-1Fucoidan干预。酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性;荧光底物法检测细胞质中溶酶体组织蛋白酶B的活性;酶-底物法检测不同浓度Fucoidan(0.1、1、10、50、100 mg.L-1)对人肝脏溶酶体组织蛋白酶B活性的影响。结果氧化损伤后细胞中ROS显著升高达正常水平的185.2%,伴有SOD下降,溶酶体组织蛋白酶B活性上升至正常水平的236.7%;Fucoidan对SOD活性没有明显影响,能降低ROS水平,且对细胞质内和人肝脏溶酶体组织蛋白酶B的活性均具有抑制作用。结论 Fucoidan降低活性氧含量抗氧化损伤的作用可能与其抑制溶酶体组织蛋白酶B的活性有关。