果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建

目的 构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区(sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础。方法提取番茄基因DNA,利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因,双酶切质粒。PROP及PROSC,分别与目的基因连接,构建重组植物表达载体。结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中。结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含sbr基因的植物表达载体。     

伯氏疟原虫抗原基因高效植物表达载体的构建

目的构建果实特异启动子驱动的含伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白PbMSP4/5(Plasmodium berghei merozoitesurface protein4/5)基因的植物表达载体,并进一步提高抗原基因的表达量和免疫原性,为研制有效的转基因植物疟疾疫苗打下基础。方法分别以提取的番茄和伯氏疟原虫Anka株的基因组DNA为模板,扩增番茄果实特异表达启动子E8的核心序列(约1.11Kb)及PbMSP4/5基因(704bp),并通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOE)PCR将二者拼接,拼接后的序列为EM,并合成霍乱毒素B亚基基因CTB,共同构建重组质粒pCAMBIA1302-EM-CTB,电击法转化根癌农杆菌GV3103。结果重组质粒经酶切鉴定证明已成功转化。结论实验成功构建了以番茄果实特异启动子驱动PbMSP4/5基因、以CTB为黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体。     

广范围高效的植物乙型肝炎病毒表面抗原表达载体构建及鉴定

目的构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因的植物双元表达载体。方法采用高保真PCR方法从T—adr质粒扩出HBsAg基因，定向克隆到中间载体pUC18-DHA，经测序证实核酸序列正确后，再亚克隆到植物双元表达载体pGreen0029-GFP上，采用电击法将含HBsAg的植物表达载体转入根癌农杆菌中，并进行酶切证实。结果扩增的HBsAg片断亚克隆到中间载体，得到pUC18-HBsAg—DHA，测序证实HBsAg核酸序列正确，再与根癌农杆菌双元载体pGreen0029-GFP连接，获得含HBsAg基因的植物双元表达载体pGreen0029-HBsAg—DHA，转入根癌农杆菌，酶切证实正确。结论采用正确技术路线，构建了含HBsAg基因的植物表达载体，为下一步的转基因植物表达研究奠定了基础。     

乙型肝炎表面抗原的免疫PCR检测

目的：探讨一种适用性强、敏感性高的乙型肝炎（乙肝）表面抗原检测方法。方法：在乙肝表面抗原与相应抗体特异性反应的基础上，逐步加入生物素化抗体、亲合素-DNA耦联物，PCR扩增相应的DNA标记，通过检测DNA来反映相应抗原的量。结果：免疫PCR检测敏感度为常规酶联免疫试剂盒的300倍，结论：免疫PCR是一种适用于乙肝表面抗原的、高度敏感的检测方法。     

乙型肝炎表面抗原二步法与一步法的检测结果比较

目的探讨乙型肝炎表面抗原二步法的临床应用。方法按ELISA二步法试剂盒说明操作,并与一步法比较。结果二步法所测曲线S/CO值在所有浓度点均明显高于一步法。5例一步法HBeAg阳性而HBsAg阴性（不稀释）的样品用二步法检测均阳性,经不同倍数稀释后用一步法也为阳性。结论 ELISA二步法检测HbsAg优于一步法,能减少免疫反应的＂前带效应＂和＂后带效应＂,提高检测阳性率。     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

新生乙型肝炎表面抗原检测分析

目的了解新生乙型肝炎流行现状及趋势、性别及城乡感染状况和防治效果,为制定预防对策提供依据。方法用血清学方法检测3年7674名新生 HBsAg。结果 3年 HBsAg 平均阳性率为4.46%,且逐年下降;HBV 感染在性别及城乡之间的差异具有显著性意义。结论枣庄学院新生 HBsAg 阳性率呈下降趋势,男生高于女生,来自农村的学生高于来自城市的学生。     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

OBJECTIVE: To construct recombinant adeno-associated virus (rAAV) carrying hepatitis B surface antigen (HBsAg) gene and study the function of the expressed HBsAg. METHODS: HBsAg gene (subtype ayw) was amplified from PTHBV-1 by PCR and cloned into the adeno-associated virus vector pSNAV to form the recombinant pSNAV-HBsAg, which was transfected into BHK-21 cells by means of lipofectamine. Using G418 selection, a mixed cell line, BHK-HBsAg, was isolated, which was capable of HBsAg expression and was subsequently infected with HSV-1-HSV1-rc/Delta UL2 that was able to package the rAAV. After purification, rAAV-HBsAg was obtained. The expression of HBsAg in BHK-21 cells and 293 cells infected with rAAV-HBsAg were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the HBsAg antibodies in the sera of rAAV-HBsAg-immunized BalB/C mice were assayed by radio immunoassay. RESULTS: As detected by ELISA, the expressed HBsAg in mixed cell line mounted to 28.6+/-6.72 ng per 5 x 10(6) cells. The BHK-21 cells and 293 cells infected with rAAV-HBsAg were both capable of HBsAg expression, the amount of which augmented with the increase of multiplicity of infection (MOI). BalB/C mice immunized with rAAV-HBsAg produced anti-HBsAg antibodies. CONCLUSIONS: rAAV-HBsAg can induce humoral immune response against HBsAg and therefore can be a promising candidate hepatitis B vaccine, and in addition, it may serve the purpose of exploring possible immunotherapy for chronic HBV infection.     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

时间分辨免疫荧光分析检测乙型肝炎病毒表面抗原

目的 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是当前标记免疫分析研究应用领域的热点之一,具有高灵敏性和高特异性,用于生物分子的超微量检测.本研究者在建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法.方法 以Eu-DTTA{N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠}为示踪物,建立了用TRFIA检测乙型肝炎血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原的方法.结果 所建立的标准曲线分析范围分别为0.2～300 ng/ml,分析灵敏度为0.05 ng/ml,检测参考标准品的批内变异系数均小于10%,与免疫放射测定同时定量检测多份血清样本,相关系数高达95%.结论 TRFIA分析范围宽,灵敏度高,操作简便,具有优越的定量检测能力,价格适中,十分适合临床推广应用.     

插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss)基因真核表达载体,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础.方法 根据乙肝病毒核心抗原基因序列,设计合成3对引物,在引物中引入分别针对人、鼠敏感的CpG片段和不合CpG的片段.用PCR方法从慢性乙肝患者血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段,将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)连接,构建重组体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),进行酶切、PCR及测序鉴定.结果 乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp.所构建的pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(1ss)重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符;测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pzeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确.结论 成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss).为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础.     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

目的构建含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组腺相关病毒(rAAV)并观察目的基因的表达和功能。方法采用PCR法从PTHBV-1质粒中扩增HBsAg基因(ayw 亚型);将PCR扩增产物插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-HBsAg;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-HBsAg;用具有rAAV包装功能的HSV-1- HSV1-rc/△UL2感染BHK-HBsAg,纯化后得到rAAV-HBsAg;ELISA检测重组病毒表面抗原基因在BHK-21细胞和293细胞中的表达;用rAAV-HBsAg免疫BalB/C小鼠,RIA法检测血清中表面抗体的滴度。结果ELISA法检测到混合细胞系BHK-HBsAg中HBsAg的表达量为(28.6±6.7)ng/5×106细胞;rAAV-HBsAg感染BHK-21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达,表达量随感染复数的增加而升高;rAAV-HBsAg免疫的BalB/C小鼠能产生表面抗体(抗-HBs抗体)。结论rAAV-HBsAg在体外能表达,免疫动物能诱导体液免疫反应的产生。rAAV-HBsAg有希望成为乙型肝炎候选疫苗,也可以进一步用于探索慢性乙型肝炎的免疫治疗。     

乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究

目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性。方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cD-NA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA法检测血清中表面抗体(抗一HBs)滴度;51Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果外源性HBsAg基因己整合到肝细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,表达水平最高可达33.8pg/(mglivertissue),rAAV-HBsAg免疫小鼠后可以诱导机体产生表面抗体并激发特异性CTL。结论外源性HBsAg基因可以转移到小鼠肝细胞并稳定表达;rAAV-2-HBsAg免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。提示基于rAAV-2载体的乙型肝炎(HBV)疫苗,对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗可能只有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究。     

乙型肝炎病毒表面抗原和抗体双阳性患者外周血T淋巴细胞亚群分布

目的 观察乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和表面抗体(HBsAb)双阳性患者外周血T淋巴细胞亚群分布。方法 以2014—2020年上海市第十人民医院和无锡市第九人民医院收治36例HBsAg和HBsAb双阳性患者为实验组,以同期无锡市第九人民医院40例HBsAg阳性、HBsAb阴性患者作为对照组。采用流式细胞术检测并比较实验组和对照组患者外周血CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞比例,采用Pearson相关分析评价患者外周血T细胞比例及血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平与血清HBsAb水平间的相关性。结果 实验组和对照组患者中位年龄、性别构成、ALT及AST水平、HBV DNA载量>10³copies/mL患者比例、HBV E抗原(HBeAg)阳性率、HBV E抗体(HBeAb)阳性率、HBV核心抗体(HBcAb)阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组和对照组患者外周血CD3⁺[(71.83±1.50)%vs(72.75±1.47)%;t=0...     

时间分辨荧光免疫分析法测定乙肝HBsAg的临床意义

目的探讨时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的临床意义。方法分别用TRFIA和ELISA法测定206例我院消化科和感染科病人血清标本的HBsAg的定量及定性结果,并对其中的高、中、低HBsAg浓度标本各20例重新进行两种方法的测定并进行比较。结果①206例标本中,血清HBsAg阳性TRFIA法98例,ELISA法85例,两方法差异有统计学意义(χ2=11.08,P<0.01)。两法符合率为93.69%。②高、中浓度标本两法测定HBsAg阳性均为20例,两方法阳性检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。而在低浓度标本中HBsAg阳性TRFIA法20例,ELISA法14例,两方法差异有统计学意义(χ2=4.17,P<0.05),TRFIA法阳性检出率要高于ELISA法。结论采用TRFIA法定量检测HBsAg灵敏度更高,线性范围更宽,在低浓度标本检测中更具优势,更具有临床意义。     

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达简

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原（HBs）嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCVAR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H—AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV—HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-s真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCVAR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24HAR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA—AR3-S构建正确,Westernblot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H—AR3和pCMV—HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。