PTEN在胚胎早期心脏发育过程中的作用

目的通过过表达PTEN,探讨胚胎早期原肠胚形成期PTEN表达及在早期心脏发生发育过程的作用和意义。方法用改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育待其发育到HH4期,对鸡胚心肌干细胞(Cardiac Stem Cell)进行PTEN电转染,转染成功后一部分鸡胚37℃孵箱继续培养30 h,待其发育形成心管,观察过表达PTEN对心管发生的影响;另一部分鸡胚在超净台内完成心肌干细胞的离体,体外培养使其分化发育成心肌组织,主要研究PTEN在细胞增殖、分化和凋亡过程中的作用。结果 30 h后鸡胚整体的免疫组织化学(N-cadherin)结果显示,PTEN-WT组和PTEN-G129E组鸡胚心管出现了反向环化、多囊化等畸形,GFP组和PTEN-C124S组心管发育受到的影响较小;转染后离体培养得到的心肌组织的跳动频率与GFP组下降的速度加快,且维持时间缩短,GFP组与PTEN-WT组差异有显著性(P<0.05),PTEN-WT组与PTEN-C124S组、PTEN-G129E组差异无显著性(P>0.05)。结论 PTEN蛋白酯酶可能参与早期胚胎心肌干细胞之间黏附分子的表达从而调节细胞迁移、分化发育,并加速了心肌组织的衰老...     

胚胎心肌干细胞体外的分化※

目的鸡胚原肠胚形成期含有心肌干细胞（cardiac stem cell, CSC）的生心区原条组织离体后体外培养,使其增殖分化成具有舒缩功能的心肌组织。方法 改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育,待胚胎发育到原肠胚的HH4期,无菌环境内选择性离体胚胎生心区原条组织（原条组织的前25%～40%）于10%FBS DMEM-F12培养基中培养,2 ～5 d后得到局部跳动的细胞组织,通过原位杂交、免疫组织化学、DiI示踪和细胞的超微结构鉴定是否分化为心肌组织。结果 FGF8特异性表达于心管和神经管;N-cadherin特异性表达于心管、神经管和体节;DiI标记的细胞迁移参与心管的形成;细胞的超微结构显示心肌组织特有的结构--闰盘。结论 CSC体外培养可以定向分化发育成心肌组织,为进一步研究心肌细胞的发育分化和生理药理学实验提供了良好的平台。     

胚胎心肌干细胞体外的分化

目的 鸡胚原肠胚形成期含有心肌干细胞(cardiac stem cell, CSC)的生心区原条组织离体后体外培养,使其增殖分化成具有舒缩功能的心肌组织.方法 改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育,待胚胎发育到原肠胚的HH4期,无菌环境内选择性离体胚胎生心区原条组织(原条组织的前25%～40%)于10%FBS DMEM-F12培养基中培养,2～5 d后得到局部跳动的细胞组织,通过原位杂交、免疫组织化学、DiI示踪和细胞的超微结构鉴定是否分化为心肌组织.结果 FGF8特异性表达于心管和神经管;N-cadherin特异性表达于心管、神经管和体节;DiI标记的细胞迁移参与心管的形成;细胞的超微结构显示心肌组织特有的结构--闰盘.结论 CSC体外培养可以定向分化发育成心肌组织,为进一步研究心肌细胞的发育分化和生理药理学实验提供了良好的平台.     

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究

目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的鼠胚胎干细胞系,并研究体外诱导鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,Es细胞）向角膜上皮细胞分化的可能性及条件,为角膜损伤提供新型的上皮修复组织来源。方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠胚胎干细胞,对稳定表达GFP的ES细胞以Ⅳ型胶原作为诱导条件,定向诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞转化,观察培养后形态改变,免疫荧光及RT-PCR检测K12、K14及CD44的表达。结果转染后ES细胞稳定表达GFP,成功诱导出角膜上皮样细胞,呈典型上皮样细胞形态,免疫组化及RT-PCR检测显示,K12及CD44表达阳性,K14表达阴性。结论转染GFP的ES细胞,在Ⅳ型胶原的诱导下,成功向角膜上皮细胞分化。     

GFP转基因鼠胚胎神经上皮 干细胞的体外培养

目的观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）转基因鼠来源的胚胎神经上皮干细胞体外增殖和分化的情况。方法将来源于孕11dGFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞与普通大鼠神经上皮干细胞进行体外培养,比较二者克隆增殖、分化的状况。结果GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞可在体外进行克隆增殖,并能分化为神经元和神经胶质细胞,与普通鼠神经上皮干细胞比较没有差异。结论GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞可在体外克隆及分化,并能稳定地表达绿色荧光蛋白。     

调控Notch信号通路对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响

目的:观察Notch信号通路调控对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响。方法:实验分为两部分:调控Notch信号通路开关,研究其对胚胎干细胞向心肌细胞分化比例的影响及心肌分化相关蛋白表达的影响。在小鼠胚胎干细胞培养的基础上,加入Notch信号激活剂Jagged蛋白(5mg/L)或Notch信号抑制剂MW167(100μmol/L)作用14d,检测:①自发性节律收缩细胞的出现情况;②心肌特异性收缩蛋白的表达情况,计算胚胎干细胞分化为心肌细胞的比例;③采用Westernblot方法检测胚胎干细胞源性心肌细胞中心肌分化相关蛋白(Nkx2.5、GA-TA4、Tbx5、Myocardin)的表达。结果:与对照组(胚胎干细胞自发分化组)相比,加入Jagged蛋白后,胚胎干细胞向心肌细胞分化的比例和早期心肌分化相关蛋白表达水平均显著减少;而加入MW167后,分化比例及早期心肌分化相关蛋白均显著增加。结论:胚胎干细胞中加入Jagged蛋白持续激活Notch信号,抑制了胚胎干细胞向心肌细胞分化;而加入MW167持续抑制Notch信号,则促进了胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

小鼠尾静脉注射与心肌注射腺病毒载体转染效率的比较

目的比较小鼠尾静脉注射或心肌注射腺病毒载体后心脏组织和肝脏组织中靶基因的转染效率。方法构建表达绿色荧光蛋白GFP的腺病毒载体(GFP-Ad)。C57BL/6小鼠20只随机分为尾静脉注射腺病毒载体组与心肌注射腺病毒载体组各10只,用实时定量PCR检测不同时间点小鼠心肌组织和肝脏组织中GFP的mRNA表达水平,并且通过荧光显微镜观察GFP荧光表达情况。结果心肌注射腺病毒载体组心脏组织中GFP的mRNA表达水平明显高于尾静脉注射腺病毒载体组,心肌注射腺病毒载体组心脏组织中荧光强度明显增强。同时,我们发现两组的肝脏组织中GFP的mRNA表达水平和荧光强度均明显高于心脏组织中;且在尾静脉注射腺病毒载体组,肝脏组织中GFP的mRNA表达水平和荧光强度在7 d达高峰,而心肌注射腺病毒载体组则在3 d达高峰。结论提高心脏组织中靶基因的转染效率宜采用心肌注射腺病毒载体的方法;对于肝脏组织转染效率,两种注射方法均可,鉴于尾静脉注射腺病毒载体的方法创伤小,宜采用。     

NGF和PTEN双基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化效果观察

目的探讨神经生长因子（NGF）的过表达（NGFhigh）与10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源物丢失（PTEN）的下调（PTENlow）相结合对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）提升周围神经再生能力的影响。方法将绿色荧光蛋白（GFP）标记的OriCellTMSD大鼠MSC（MSC/GFP）分为两组,实验组通过NGF基因稳定转染和PTEN基因的小干扰RNA干扰瞬时沉默构建双基因修饰的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP,对照组为未经基因修饰的大鼠MSC/GFP。采用细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8）和氧-葡萄糖剥夺实验检测两组细胞的增殖和凋亡情况;实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测两组细胞NGF、PTEN和巢蛋白-1（Nestin-1）mRNA和蛋白表达情况。结果CCK-8检测结果显示双基因修饰的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP具有更强的增殖能力;氧-葡萄糖剥夺模型中NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP具有更强的生存能力;qRT-PCR和Westernblot结果显示,双基因修饰上调了NGF、Nestin-1的表达和下调了PTEN的表达。结论双基因修饰的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP具有更强分化为神经元样细胞的能力,因此,双基因定向诱导大鼠MSC分化有利于神经元再生,从而提升周围神经再生能力。     

Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

目的研究Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用。方法实验组以二甲基亚砜（DMSO）作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt8a的表达,对比分化率。结果两组在分化第2,3,4天Wnt8a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为92.22%,对照组分化率为37.78%,差异性具有统计学意义。结论Wnt8a促进小鼠胚胎心肌分化。     

GATA-4在心肌损伤修复中的作用机制研究进展

GATA-4是调控心脏基因表达的重要转录因子,参与了心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程。GATA-4在心脏发育的早期起重要作用,抑制胚胎干细胞中GATA-4的表达可阻断胚胎干细胞向心肌细胞分化,增强GATA-4的表达则增加胚胎干细胞向心肌细胞分化。并且GATA-4还具有抗细胞凋亡的作用,GATA-4在心肌肥大期间成体心肌细胞的凋亡过程中具有重要的作用。通过增加促存活基因的表达,可改善细胞的存活。其在心肌损伤修复、缺血性心脏病治疗等方面成为目前研究的热点。     

一种在体基因干扰技术研究神经嵴细胞向平滑肌细胞的分化

目的建立一种在体基因干扰技术研究神经嵴细胞向平滑肌细胞分化。方法使用鸡胚在体电转染的方法导入绿色荧光蛋白示踪或核内不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleprotein A2/B1,hnRNPA2/B1)特异性吗啉基反义寡聚核苷酸(morpholino)干扰其基因表达。通过分析鸡胚的成活率及转染率确定在体转染的设备参数,之后将胚胎固定、包埋、冰冻切片并进行免疫组织化学染色,在荧光显微镜下观察神经嵴细胞的标记、迁徙及向平滑肌细胞的分化。结果转染电压为7.5V时胚胎成活率和转染率均较高,因此在本实验中作为标准电压。电转后6小时,右侧神经嵴细胞成功表达绿色荧光蛋白。第2天,神经嵴细胞开始向腮弓迁徙并达到第2、3鳃弓。hnRNPA2/B1特异性morpholino可以抑制hnRNPA2/B1的表达从而影响神经嵴细胞的迁徙和分化,导致鳃弓动脉平滑肌层形成障碍,最终破裂。结论鸡胚在体基因干扰技术被成功建立并可用来研究神经嵴细胞向平滑肌细胞分化。     

不同体外微环境条件对精子生存质量的影响

目的探索精子生存质量最佳的体外微环境条件。方法收集禁欲5~7 d的精液标本30份,精液处理前将梯度离心液和冲洗液分别放在37℃恒温水浴箱（甲组）和室温（乙组）中复温,室温下液化后以密度梯度离心处理并且洗涤1次,然后分别放在室温（条件A）、37℃6%CO2培养箱（条件B）、37℃恒温水浴箱（条件C）3种不同培养条件下保存,于24 h、48 h和72 h检查精子的存活率。结果培养液在甲组中复温的精子24 h、48 h和72 h的存活率（74.0±9.4）%、（68.2±13.6）%（、52.9±26.5）%,略高于乙组的（70.5±16.2）%、（61.1%±15.8）%、（50.5%±17.4）%,但两组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。培养液在甲组或乙组复温并处理后,精子在体外微环境条件下培养随着时间延长其存活率均有降低趋势,而在保存时间相同情况下,培养在室温（条件A）中的精子与培养在37℃恒温水浴箱（条件C）内的精子存活率比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但是培养在37℃6%CO2培养箱（条件B）内的精子存活率显著低于培养在室温或37℃恒温水浴箱内的精子的（P〈0.05）。结论精液处理前所用培养基最好放置于37℃恒温水浴箱中复温,处理好的精子应立即做授精准备。     

重组腺病毒AD-PTEN转染肾脏成纤维细胞对其细胞周期的影响

目的 将携带有PTEN基因的重组腺病毒转染大鼠肾脏成纤维细胞,观察其过度表达PTEN对细胞周期的影响.方法 以免疫组化的方法确定PTEN在成纤维细胞中的亚细胞定位,以Ad-PTEN转染成纤维细胞,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况及亚细胞定位,将转染的成纤维细胞及正常对数生长期成纤维细胞消化,流式细胞仪分别检测细胞周期.结果 免疫组化结果显示成纤维细胞的胞浆和胞核中均有PTEN的表达,在胞核中表达水平更高,荧光倒置显微镜下观察Ad-PTEN转染成纤维细胞后外源性PTEN其标志物绿色荧光蛋白(GFP)在胞浆和胞核中均表达,其中胞核表达水平更高,流式细胞仪检测在成纤维细胞中病毒转染组G1/S均明显高于对照组,提示Ad-PTEN转染组细胞存在明显的G1期细胞阻滞.结论 PTEN过度表达将引起肾脏成纤维细胞周期G1期阻滞,这一过程与PTEN在细胞核定位有关.     

IGF-1基因转染对大鼠成肌细胞增殖和分化的影响

目的：探讨人类胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）基因转染对骨骼肌成肌细胞增殖和分化的作用及机制。方法：分别用pLghIGF-1SN质粒和对照质粒pLgGFPSN转染成肌细胞作为IGF组和GFP组,未转染成肌细胞作为细胞对照（Control）组。转染后用免疫细胞化学、RT-PCR检测hIGF-1基因在成肌细胞中的表达。MTT方法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测成肌细胞的细胞周期变化。通过检测细胞融合率与磷酸肌酸激酶（CK）含量检测IGF-1基因转染对成肌细胞分化的影响。结果：基因转染后免疫细胞化学和RT-PCR检测发现IGF组细胞有hIGF-1表达,GFP组和Control组细胞未见hIGF-1表达;MTT检测显示IGF组成肌细胞光吸收值增大,与Control组和GFP组细胞相比,差异有显著性（P〈0.05）;流式细胞仪检测显示：与对照组和GFP组相比,IGF组G1期细胞百分比显著下降（P〈0.05）,S期细胞百分比则显著增加（P〈0.05）。与对照组和GFP组相比,IGF组成肌细胞融合率和CK合成显著增加（P〈0.05）。结论：IGF-1基因转染对成肌细胞的增殖与分化均具有促进作用,其作用是通过减少G1期成肌细胞数量,增加S期细胞数量实现的。     

非CO2依赖型细胞培养系统对膀胱癌T-24细胞增殖的影响

目的 探讨非CO₂依赖型细胞培养系统对膀胱癌T-24细胞增殖的影响。方法 对膀胱癌T-24细胞采取非CO₂依赖型细胞培养系统在（37℃ 、大气环境) 培养箱（大气-B组）和（37℃、5%CO₂）培养箱（CO₂-B组）条件下,及CO₂依赖型细胞培养系统在（37℃、大气环境) 培养箱（大气-A组）和（37℃、5%CO₂）培养箱（CO₂-A组）条件下进行培养,检测分析两种体系培养基连续7d pH的比较结果;采用细胞增殖曲线及克隆形成实验检测细胞生长差异情况;采用流式细胞术检测分析两种系统对细胞周期及凋亡率影响的比较结果; RT-PCR、Western blot技术检测分析两种系统下的膀胱癌细胞中survivin、caspase-3基因及蛋白的表达情况。结果 两种培养系统条件下,细胞培养基pH变化趋势一致;两种培养系统下T-24细胞生长增殖未见差异;RT-PCR 法及Western bolt法检测显示,两种培养系统下表达survivin、caspase-3因子及蛋白未见差异。结论 膀胱癌非CO₂依赖型细胞培养系统对细胞增殖、基因表达等方面与膀胱癌CO₂依赖型细胞培养系统无明显区别。     

流式细胞术同时检测GFP和PI细胞的预处理方法

目的：以绿色荧光蛋白（GFP）作为报道基因,探讨转染GFP的培养细胞检测细胞周期的流式细胞技术。方法：用贴壁细胞MCF-7细胞以脂质体转染PEGFP—C,,转染后24h收集细胞,分别用70％乙醇固定、1％多聚甲醛固定和1％多聚甲醛固定后用透膜齐3透膜PI染色,以非转染细胞作为阴性对照,转染CFP非固定细胞作为阳性对照,用流式细胞仪检测。结果：用70％乙醇固定细胞导致GFP完全淬灭;用1％多聚甲醛固定保持99％的GFP阳性率,荧光强度稍有下降;而经过皂素破膜和PI染色后,GFP的阳性率也能保持有原来的80％左右;1％多聚甲醛固定24h内对GFP的阳性率没有大的影响。结论：对于含有GFP基因的细胞在进行流式细胞周期的检测时,应避免使用细胞周期常规的乙醇固定方法;l％多聚甲醛固定加皂素破膜能有效保证GFP的荧光活性。     

移植胚胎数及移植优质胚胎数对妊娠结局的影响

目的：探讨体外受精-胚胎移植（IVF—ET）周期中,移植胚胎数及移植优质胚胎数对妊娠结局的影响。方法：回顾性分析行辅助生殖（IVF／ICSI）治疗并新鲜移植的病例共4190个周期,根据患者年龄分为〈35岁组,35～37岁组和≥38岁组,分别统计各年龄段移植1、2、3个胚胎和移植0、1、2、3个优胚的临床妊娠率、单胎妊娠率、多胎妊娠率和异位妊娠率。结果：（1）〈35岁组中,移植1、2个胚胎的临床妊娠率无统计学差异,移植1、2个优胚者获得了相似的临床妊娠率,显著高于无优胚移植者;移植2个优胚者,多胎妊娠率显著高于移植1个优胚者。（2）35-37岁组,移植2个或3个胚胎的临床妊娠率无统计学差异,且明显高于移植1个胚胎者;移植1、2、3个优胚的临床妊娠率显著高于无优胚移植者,同时移植3个优胚者,其多胎妊娠率及异位妊娠率均显著增加。（3）在≥38岁组中,无论是移植2个或3个胚胎,还是2个或3个优胚,其临床妊娠率均显著高于移植1个胚胎及1个优胚者,且移植3个优胚者其多胎妊娠率及异位妊娠率也明显提高。结论：年龄〈35岁的患者和35—37岁的患者可以分别选择1个和2个优质胚胎移植,年龄≥38岁的患者应尽量避免移植3个优质胚胎,以减少多胎妊娠及异位妊娠的发生。     

miR-20a靶向PTEN调控垂体腺瘤细胞的增殖与侵袭

目的探讨miR-20a对垂体腺瘤细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制。 方法培养垂体腺瘤细胞系GH3、HP75,采用RT-qPCR、Western blotting、双荧光素酶报告基因检测等方法,分析垂体腺瘤细胞系中miR-20a和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达相关性以及相互作用情况;采用CCK8和Transwell等方法检测miR-20a对垂体腺瘤细胞增殖和侵袭能力的影响,进一步考察对PTEN下游PI3K/AKT信号通路的影响。 结果 miR-20a负调控PTEN的表达。体外细胞实验显示,与miR-20a类似物对照组相比,类似物组在垂体腺瘤细胞系GH3和HP75中细胞迁移细胞数量、细胞增殖相关蛋白PI3K、AKT、MAPK和侵袭相关蛋白E-cadherin、MMP2和MMP9的表达量均增高,差异均有统计学意义(P < 0.01);与抑制物对照组相比,miR-20a抑制物组在GH3和HP75中细胞迁移细胞数量和各蛋白表达量均下降,差异均有统计学意义(P < 0.01);双荧光素酶报告基因分析发现与miR-20a类似物对照组比较,类似物组PTEN-WT的活性降低(P < 0.01)。 结论miR-20a在调节细胞的增殖和侵袭的过程中扮演非常重要的作用,因而影响了垂体腺瘤细胞的增殖和侵袭。它可能通过靶向PTEN,影响PI3K/AKT信号通路,参与垂体腺瘤的进程中。     

保温箱内蓝光治疗早产儿黄疸时体温调节的护理

目的:探讨早产儿黄疸暖箱内蓝光治疗时体温变化及干预措施。方法:对60例早产儿随机分成干预组和对照组,干预组在蓝光治疗前测量体温一次,当体温在36.5~37.5℃,降低暖箱温度1℃,<36.5℃,降低暖箱温度0.5℃;对照组直接进行蓝光治疗。观察两组在蓝光治疗期间发热的发生率。结果:干预组发热的发生率20.0%,对照组66.7%。差异有统计学意义(P<0.005)。结论:早产儿在蓝光治疗时根据蓝光治疗前测量的体温来调节暖箱的温度,可有效的降低早产儿光疗时发热的发生率。