体外培养人骨髓基质细胞的超微结构

体外培养人骨髓基质细胞的组成及功能与人体造血微环境相似，可作为研究人体造血微环境的良好模型。选择体外培养第４周的人周髓基质细胞层，经固定、脱水、原位包埋、超薄切片染色后电镜观察。结果：可见基质层由３类基质细胞及ＥＣＭ组成。     

体外培养人骨髓基质细胞的超微结构

体外培养人骨髓基质细胞的组成及功能与人体造血微环境相似，可作为研究人体造血微环境的良好模型。选择体外培养第４周的人骨髓基质细胞层，经固定、脱水、原位包埋、超薄切片染色后电镜观察。结果：可见基质层由３类基质细胞及ＥＣＭ组成。巨噬样细胞样基质细胞浆内可见ＣＩ；基质细胞表面ＥＣＭ包含胶原纤维；内皮细胞样基质细胞间可见细胞间连接，但这种连接未见于造血祖细胞及其他基质细胞间。结论：人骨髓体外培养基质细胞超微结构与人体及小鼠骨髓微环境既有相似也有不同处，其差异可能由于体内外不同生长条件所引起。     

SD大鼠骨髓基质细胞与多孔羟基磷灰石陶瓷支架体外粘附的实验研究

目的研究诱导培养的SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料上的粘附和生长。方法SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)经矿化诱导培养、扩增后与多孔羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养,扫描电镜观察BMSCs在支架表面的贴附形态;同时以不同浓度细胞悬液接种多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料,检测适宜的接种浓度及单位体积支架材料最多可粘附BMSCs数量。结果BMSCs在支架表面贴附良好,当接种浓度为2×106/ml时,单位体积的多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料最多可粘附BMSCs数量为3.1×107cell/cm3。结论SD大鼠BMSCs在体外经矿化诱导培养可表达成骨细胞表型,诱导培养后的细胞与新型多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料上具有良好的亲和能力。     

儿童骨髓基质细胞体外培养

目的 探讨儿童骨髓基质细胞体外培养条件,为儿童骨组织工程研究选择种子细胞。方法 将儿童髂骨内骨髓分别采用密度梯度离心法和全骨髓法培养,待细胞长满培养瓶后传代,选取正常生长骨髓基质细胞第3代绘制生长曲线并测定细胞内骨钙素(OCN)及培养液中碱性磷酸酶(ALP)含量。培养期间用倒置相差显微镜观察细胞形态。结果 原代儿童骨髓基质细胞呈长梭形、三角形或多角形,存在有集落样生长特性,传代后细胞形态无明显变化,且生长、增殖稳定,细胞内OCN及培养液中ALP含量在1周左右达到高峰。结论 采用密度梯度离心法和全骨髓法获得儿童骨髓基质细胞,经培养、传代后,可以得到大量稳定增殖的骨组织工程种子细胞。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的：探讨兔骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外培养的生长特点,为骨组织工程种子细胞的选择奠定基础。方法：取三月龄新西兰大白兔经转子窝抽取骨髓,制成细胞悬液进行培养,通过倒置显微镜、透射电镜(TEM)、HE染色等观察细胞的生物学特性,计算细胞的生长曲线、贴壁率和分裂指数。结果：BMSCs在体外生长良好,传代后性状稳定,增值期为2～4d,12h贴壁率为90％,第4天时分裂指数最高为92‰。结论：兔BMSCs体外培养时生长性状稳定,增殖速度快,可作为骨组织工程的种子细胞。     

髓内脂肪细胞对骨髓基质细胞超微结构的影响

目的 研究来源于骨髓基质细胞的髓内脂肪细胞对其超微结构的影响。方法向骨髓基质细胞的培养板中加入不同浓度(0，10^3，10^4，10^5，10^6／mL)的脂肪细胞悬液，共培养12d，每4d取单层细胞爬片，经固定、脱水、原住包埋，超薄切片后电镜观察骨髓基质细胞细胞超微结构。结果共培养体系中，骨髓基质细胞表面绒毛及伪足减少，线粒体数目增加用轻度肿胀，细胞核浓聚，染色质边集，核型不规整甚至碎裂。结论从形态学上证实了脂肪细胞能改变骨髓基质细胞的超微结构。     

成人骨髓基质细胞体外培养及鉴定

目的 :探讨简易的成人成骨细胞体外培养方法 ,为进一步研究成骨细胞及骨组织工程提供技术平台。方法:手术中抽取健康成人骨髓组织 ,采用全骨髓培养法在体外进行培养 ,细胞汇合后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C的条件培养基进行传代培养 ,观察细胞增殖和分化情况 ,并对细胞进行鉴定。结果:培养的成人成骨细胞表现出成骨细胞的形态特征 ,细胞碱性磷酸酶 (AL P)阳性率为 6 8% ,经 Von Kossa's染色证实其能最终形成钙结节。结论:全骨髓培养法所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养及鉴定

目的观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件，为诱导骨髓基质分化形成神经干细胞、神经元，以及移植鼠骨髓基质细胞治疗帕金森病大鼠奠定基础。方法取60～90g SD大鼠，体外培养骨髓基质细胞，利用倒置相差显微镜观察原代及不同传代细胞生长形态特点，并应用流式细胞仪鉴定原代及不同传代细胞表型。结果培养的骨髓基质细胞第3代，间充质干细胞的细胞表面标志CD90表达阳性的细胞已占到92．9％。造血干细胞的表面标志CD45表达阳性的细胞已从原代的73．4％降低到2．3％。结论传3代的细胞适合于细胞诱导分化，可作为理想细胞移植治疗的细胞来源。     

体外培养及成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞生长的 …

目的 研究体外培养及成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞生长的影响。方法 抽取兔骨髓基质细胞体外培养,倒置显微镜动态观察,从原代培养（Ｐ０）中观察到细胞集落的形态有明显差异,提示骨髓基质细胞是一个由多样细胞组成的混合体。在培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ,５ｎｇ／ｍｌ）。结果 第一代细胞（Ｐ１）的生长速度增至对照组的１．５倍。而未经ｂＦＧＦ处理的细胞活跃增殖能力只能保持４～５代,随后即发生     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。     

珊瑚羟基磷灰石植入修复良性骨肿瘤缺损

目的: 观察无机材料珊瑚人工骨修复良性骨肿瘤刮除术后骨缺损的临床疗效.方法: 将天然珊瑚经特殊处理加工成羟基磷灰石,作为骨修复的填充材料,植入骨肿瘤刮除术后骨缺损区.共治疗25例患者,均为良性骨肿瘤.缺损范围最大10 cm×3.5 cm×2 cm,最小0.8 cm×0.5 cm×0.5 cm.结果: 所有病例术后查血生化正常,伤口愈合良好,无异物排出现象.X线显示:1月后管状骨周围有骨痂生长,3月植入的珊瑚骨密度开始逐渐降低,而珊瑚骨之间的空隙密度增高,4月达到临床愈合,18月珊瑚羟基磷灰石基本完全吸收.结论: 天然珊瑚制成羟基磷灰石具有良好的生物相容性和骨传导性,而且生物降解时间延长,基本与骨形成达到同步,是一种较为理想的骨缺损修复材料.     

Effect of gamma irradiation on nuclear factor—kappa B in cultured bone marrow stromal cells

Objective: To explore the effect of gamma irradiation on nuclear factor-kappa B in cultured bone marrow stromal cells. Methods: Immunocytochemistry, Western blot and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) were used. Results: The expression of NF-kB in cultured mouse bone marrow stromal cells (BM-SCs) on the level of protein was elevated after exposure to 60Co in the dosage of 8. 0 Gy with the use of im-munocytochemistry and Western blot. The activity of nuclear factor-kappa B in cultured BMSCs was significantly increased after exposure to gamma irradiation by using EMSA. The activity peak was at the 4th h after irradiation. Conclusion: Our results suggest that the activation of nuclear factor-kappa B in the BMSCs after irradiation may be involved in the protection of BMSCs against apoptosis and in the recovery of hematopoiesis after radiation.     

微波对体外培养的骨髓基质细胞脂质过氧化损伤

目的 :观察微波对体外培养的骨髓基质细胞的脂质过氧化损伤作用 .方法 :体外培养骨髓基质细胞 ,微波按强度分为 3组 (10 ,2 0和 30mW·cm-2 ) .辐照 1h ,共进行 2次试验 ,每次每组 4瓶细胞 .辐照后立即测定SOD活性 ,MDA含量 ,检测细胞存活率 .用方差分析进行统计分析 .结果 :微波辐照后 ,2 0mW·cm-2 组和 30mW·cm-2 组SOD活性下降(P <0 .0 1) ,MDA含量升高 (P <0 .0 1) ,细胞存活率明显下降 .结论 :在本实验条件下 ,微波可引起体外培养的骨髓基质细胞的脂质过氧化损伤     

原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 :原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞 ,比较两种原代培养细胞形态、生长状况的差异性 .方法 :以骨髓悬液直接贴壁培养的方法获取骨髓基质细胞 ,以Per coll细胞分离介质 (质量浓度 10 73g·L-1)分离出骨髓悬液中的骨髓间充质干细胞 ,用含 10 0mL·L-1胎牛血清的DMEM培养液分别进行培养 ,观察细胞的生长状况 .结果 :原代培养的骨髓基质细胞增殖迅速 ,扩增细胞基本都呈形态均一成纤维样细胞 ,接种 1wk后细胞已长满 ,3wk后可形成钙化结节 .原代培养的骨髓间充质干细胞增殖缓慢 ,细胞增殖情况和增殖细胞形态不均一 ;有一些细胞在 4wk的培养时间内未见明显增殖 ,这些增殖不明显的细胞有的未见明显的伸张 ,呈圆形 ,有的伸展充分 ,成片状 ,偶见有神经元样的细胞出现 ;在培养 2wk后也可见一些出现明显增殖的细胞 ,分别形成克隆团状或条带状的细胞群 .结论 :非诱导条件下原代培养扩增的骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞不同 ,前者种类均一 ,可自发向成骨方向发展 ;后者则表现出间充质干细胞的多向分化潜能 .     

大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞的分化。方法： 用DMEM培养液冲洗骨髓,收集骨髓细胞接种在培养瓶中体外扩增、纯化。用诱导剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化ABC法鉴定神经丝蛋白（NF-200）、微管相关蛋白（MAP-2）、神经元特异核蛋白（NeuN）、巢蛋白(Nestin) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAD和ChAT的表达。结果： BMSCs经诱导后,胞体增大,并伸出细长突起,与神经元形态相似。免疫组化显示大部分细胞NF-200,MAP-2,NeuN和Nestin表达阳性,(3±0.8)%的细胞GAD表达阳性,(5±0.3)%的细胞ChAT表达阳性,而GFAP 表达阴性。结论： BMSCs可被诱导分化为神经元样细胞,部分细胞可表达GAD与ChAT。     

脂质体介导外源性基因在骨髓基质细胞表达

目的：用阳离子脂质体介导真核表达载体pEGFP-PDX-1转染大鼠骨髓基质细胞，并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法：构建的重组载体鉴定后，以脂质体介导其转染骨髓基质细胞,改变DNA,脂质体的量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率；转染后48 h进行细胞免疫组化染色检测目的基因的表达情况。结果：限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX-1基因；克隆的目的片断经序列测定与GenBank公布的序列一致；质粒∶脂质体为1∶1或1∶2的转染效率最佳；细胞免疫化学染色检测证实转染后骨髓基质细胞有PDX-1基因表达。结论：成功构建了含有PDX-1基因的真核表达载体；通过优化转染条件提高了pEGFP-PDX-1转染大鼠骨髓基质细胞的效率,为成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。     

骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞体外培养的成骨能力,为细胞移植修复骨缺损提供一条新途径。方法 取新西兰大白兔股骨大转子处骨髓,进行体外培养,纯化,10－14天后进行转代。培养后的细胞经倒置显微镜,透射地镜,钙染色,碱性磷酸酶染色等方法进行观察。结果 培养纯化后的细胞呈梭形,多角形,电镜显示具有分泌功能旺盛的结构,碱性磷酸酶染色强阳性,培养3－4周后,能形成钙结节。细胞在体外能多次传代,维持成骨表型。结论 骨髓基质细胞在体外培养纯化后,骨与成骨细胞相似的形态结构和生物学特性,能形成钙化的骨样组织。     

Comparative study on seeding methods of human bone marrow stromal cells in bone tissue engineering

Background In general the traditional static seeding method has its limitation while the dynamic seeding method reveals its advantages over traditional static method. We compared static and dynamic seeding method for human bone marrow stromal cells (hBMSCs) in bone tissue engineering.Methods DNA assay was used for detecting the maximal initial seeding concentration for static seeding. Dynamic and static seeding methods were compared, when scaffolds were loaded with hBMSCs at this maximal initial cell seeding concentration. Histology and scanning electron microscope(SEM) were examined to evaluate the distribution of cells inside the constructs. Markers encoding osteogenic genes were measured by fluorescent RT-PCR. The protocol for dynamic seeding of hBMSCs was also investigated.Results DNA assay showed that the static maximal initial seeding concentration was lower than that in dynamic seeding. Histology and SEM showed even distribution and spread of cells in the dynamically seeded constructs, while their statically seeded counterparts showed cell aggregation.Fluorescent RT-PCR again showed stronger osteogenic potential of dynamically seeded constructs.Conclusion dynamic seeding of hBMSCs is a promising technique in bone tissue engineering.