Notch 3沉默对人急性T淋巴细胞白血病细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨Notch 3受体特异性沉默对急性T淋巴细胞白血病的影响。方法：运用survivin启动子介导的RNA干涉方法特异性地封闭急性T淋巴细胞白血病细胞SupT1中Notch 3基因的表达。结果：survivin启动子介导的RNA干涉系统能特异而高效封闭肿瘤细胞内源Notch 3基因的表达,Notch 3基因表达的下调能够使肿瘤细胞的增殖活性降低,凋亡明显增加。结论：Notch 3基因沉默可有效抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,为急性T淋巴细胞白血病相关基因功能研究及靶向性治疗探索了一种新策略。     

Notch1基因表达对急性T淋巴细胞白血病SupT1细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨Notch信号通路与急性T淋巴细胞白血病发生、发展的关系。方法利用携带Notch1特异性和非特异性shRNA的慢病毒载体包装成的病毒颗粒感染急性T淋巴细胞白血病SupT1细胞,采用CCK．8法检测细胞抑制率;采用流式细胞术检测细胞凋亡率（AnnexinV＋／7-AAD一和AnnexinV＋／7-AAD＋）;采用实时荧光定量PCR法检测Notch1受体基因及下游靶基因的表达水平。结果Notch1干扰组、空白对照组和空载体组96h的细胞增殖抑制率分别为0．902±0．013、0、0．486±0．084,干扰组较空白对照组、空载体组升高（均P〈0．05）;三组细胞早期凋亡率分别为（15．27±0．31）％、（5．57±0．25）％、（5．80±0．20）％,干扰组较空白对照组、空载体组升高（均P〈0．05）;而各组细胞晚期凋亡率无明显变化（均P〉0．05）。干扰组细胞中Notch1受体基因及其下游靶基因Hes1、c-myc、NF-κB在48、72、96h的mRNA相对表达量均较空白对照组及空载体组降低（均P〈0．05）。结论特异性Notch1-shRNA可有效下调Notch1mRNA的表达,并降低其下游靶基因的表达水平。Notch1表达下调可以抑制急性T淋巴细胞白血病SupT1细胞增殖,促进supT1细胞的早期凋亡。     

ABT-199体外对急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt4细胞增殖凋亡影响及其机制研究

目的 大多数肿瘤细胞对化疗诱导细胞凋亡的耐受与Bcl-2家族蛋白有关,ABT-199是针对抗凋亡蛋白Bcl-2的选择性拮抗剂.本研究旨在探讨ABT-199体外对急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞株增殖凋亡的影响及其机制.方法 体外培养Molt4细胞,CCK8法检测不同浓度ABT-199对Moh4的增殖抑制作用,DAPI细胞核染色后荧光显微镜观察细胞凋亡特征,Annexin Ⅴ/PI双染法检测不同浓度ABT-199对Molt4细胞的诱导凋亡作用,JC-1染色法检测不同浓度ABT-199作用于Moh4细胞后线粒体膜电位的变化,蛋白质印迹法检测经ABT-199处理后线粒体信号通路相关蛋白(Bcl-2、PARP和cleaved Caspase-3蛋白)表达水平的变化.结果 ABT-199对Molt4细胞具有抑制增殖的作用,48 h的IC50值为(4.63±0.15) μmol/L.荧光显微镜观察显示,ABT-199处理Moh4细胞后细胞核染色质染色浓聚,细胞核碎裂,出现凋亡小体,且随着药物浓度的增加上述形态变化更加明显;Annexin Ⅴ/PI检测细胞凋亡结果显示,0、1、2、4、8 μmol/L的ABT-199诱导细胞凋亡的百分比分别为(3.09±1.16)％、(11.59±5.58)％、(25.37±7.42)％、(46.38±7.05)％和(80.60±11.18)％,给药组与对照组的凋亡比例差异有统计学意义,x2=18.286,v=4,P=0.001.JC-1检测结果显示,ABT-199能促使Molt4细胞的线粒体膜电位下降,呈浓度依赖性,给药组与对照组的线粒体膜电位下降比例差异有统计学意义,x2 =17.386,v=4,P=0.002.蛋白质印迹法检测结果显示,给药组线粒体通路中Bcl-2表达水平显著下降(x2=9.024,v=3,P=0.029),并出现Caspase-3下游底物多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose poly-merase,PARP)的裂解,同时出现了Caspase-3裂解片段的累积.结论 ABT-199在体外能抑制急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞的增殖及诱导其凋亡,其机制与激活线粒体信号通路相关.     

lncRNA XIST通过miR-375-Notch1轴调控急性T淋巴细胞白血病细胞增殖、侵袭的实验研究

目的 探讨lncRNA XIST通过miR-375-Notch1轴调控急性淋巴细胞白血病(T-acute lymphocytic leukemia,T-ALL)细胞增殖和侵袭的影响。方法 以2018年6月—2021年3月收治的57例T-ALL患者为观察对象(T-ALL组),另选55例同期健康体检者为对照组。qRT-PCR检测T-ALL组和对照组及T-ALL T淋巴细胞CCRF-CEM细胞株中lncRNA XIST水平;对CCRF-CEM细胞转染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST、转染miR-375模拟物以过表达miR-375;采用CCK-8法、Transwell侵袭实验法及流式细胞术检测CCRF-CEM细胞的增殖、侵袭及凋亡情况;荧光素酶报告基因方法检测lncRNA XIST靶基因;Western blot检测Notch1、ADAM-17、Hes1蛋白表达。结果 与对照组比较,T-ALL组的lncRNA XIST、Notch1 mRNA表达明显增加(P＜0.05),而miR-375水平明显下降(P＜0.05),且T-ALL组患者Notch1蛋白水平明显高于对照组(P＜0.001)。转染si-lncRNA XIST沉默lncRNA XIST后,CCRF-CEM细胞增殖数量、侵袭能力明显下降(P＜0.05),细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。荧光素酶报告基因显示miR-375是lncRNA XIST的靶点。CCRF-CEM细胞转染miR-375后,细胞增殖数量、侵袭能力明显下降(P＜0.05),细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。转染si-lncRNA XIST可以明显上调miR-375水平、下调Notch1 mRNA水平,同时下调Notch1、ADAM-17、Hes1蛋白表达。结论 lncRNA XIST在T-ALL患者中呈高表达,可能通过miR-375-Notch1轴影响白血病细胞生物学功能。     

实时荧光定量-PCR检测Notch信号通路相关分子在急性T淋巴细胞白血病中的表达

目的:检测Notch信号通路相关分子在急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)中的表达,并探讨其在T-ALL中的致病机制.方法:采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)法检测了15例初诊的T-ALL患者的骨髓和11例正常骨髓移植供者细胞中Notch1、Notch2,Notch信号配体分子Jagged1、Delta1,Notch信号途径效应分子Hes1及内参GAPDH的表达水平.结果:T-ALL组患者的骨髓中Notch1的均数表达水平明显高于健康供体组,分别为15 105.3±5 961.3和1 735.5±936.6(P=0.002);Jagged1的表达水平在T-ALL组明显低于健康供体组,分别为231.6±78.4和2 192.3±971.6, 差异有统计学意义(P=0.000).Notch2、Delta1和Hes1的表达水平在T-ALL组分别为63 067.8±9 437.5、368.2±142.5和252.7±94.2,健康供体组为52 078.2±8 476.3、2 189.8±802.3和1 006.2±806.0(P值分别为0.452、0.752和0.561), 差异无统计学意义;T-ALL组、健康供体组中Notch1和Notch2的表达差异均无统计学意义.结论:Notch1在T-ALL中高表达,而Jagged1在T-ALL则为中低表达,提示T-ALL发病与异常与Notch1信号通路有关;而Notch 2与Notch 1的表达并不平行.     

LINC00284通过miR-3127/STAT3轴促进急性T淋巴细胞白血病细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探讨LINC00284在急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)进展中的调节作用和潜在机制。方法:通过RT-qPCR检测T-ALL细胞系中LINC00284、miR-3127和STAT3的表达。将干预LINC00284、miR-3127或STAT3表达的质粒载体转染至MOLT-4细胞,通过MTT和流式细胞术测定细胞增殖和凋亡,通过Transwell测定细胞迁移和侵袭。通过生物信息网站分析和双荧光素酶报告基因检测验证miR-3127和LINC00284或STAT3之间的靶向关系。结果:T-ALL细胞系中LINC00284和STAT3表达上调,miR-3127表达下调。下调LINC00284或上调miR-3127显著抑制T-ALL细胞的增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡。LINC00284充当miR-3127的分子海绵抑制其表达,miR-3127靶向负调控STAT3表达。上调STAT3可以逆转下调LINC00284对T-ALL细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用。结论:这些发现表明LINC00284通过调...     

Notch 信号通路相关基因的mRNA在急性B淋巴细胞白血病中的表达

 目的：检测Notch信号通路相关基因的mRNA在B-ALL（急性B淋巴细胞白血病）中的表达水平,并探讨其在B-ALL中的作用。方法：建立实时定量RT-PCR方法,采用ABI PRISM 7700 PCR仪检测了16例初诊B-ALL患者骨髓（原始＋幼稚淋巴细胞≥80％）和11例正常供者骨髓中Notch1、Notch2、Jagged1、Delta1和Hes1及内参GAPDH的表达水平,以检测基因=（检测基因拷贝数/GAPDH拷贝数）×106 计算检测基因的表达水平。结果：B-ALL组骨髓中 Jagged1基因的mRNA表达水平明显低于对照组,分别为(76.7±23.8)和(2 192.3±971.6)（P=0.000）, Delat1基因mRNA表达水平B-ALL组明显高于对照组,分别为(60 316.6±8 713.5)和(2 189.8±802.3)（P=0.002）, 差异有统计学意义。Notch1、Notch2和Hes1基因的mRNA表达水平B-ALL组分别为(6 167.6±1661.3)、(95 318.6±9 437.5)和(258.2±96.2),对照组分别为(1 735.5±936.6)、(52 078.2±8 746.3)和(1 006.2±806.0)(P值分别为0.089、0.815和0.786),此三个基因在B-ALL组与对照组之间表达差异没有统计学意义。结论：Jagged1在B-ALL中低表达,Delta1在B-ALL中高表达,提示B-ALL发病与Notch信号途径中配基的异常表达有关。     

Notch信号与急性T细胞淋巴瘤白血病关系的研究进展

 Notch信号不仅能调节T细胞分化、发育,参与T细胞淋巴瘤/白血病（Acute T lymphocty lymphoma/leukemia, T-ALL）的发生、发展,还影响造血干、祖细胞生长、分化和自我更新。最常见的Notch1突变为HD区域和PEST区域的突变,活化突变的Notch信号通过PI3K/Akt信号通路、mTOR、NF-κB信号通路等诱导T-ALL的发病与发展。多项研究表明Notch受体不仅能调节T细胞发育,还参与急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）和异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）后移植物抗宿主病（Graft-versus-host Disease, GVHD）的发生,调节造血干、祖细胞生长、分化和自我更新,对造血干细胞移植后造血重建以及造血微环境的动态平衡均发挥重要作用。本文对Notch信号通路与造血系统疾病的关系及其治疗进展作一综述。     

Notch信号通路对急性B淋巴细胞白血病患者CD4+CD25+CD127dim/-调节性T细胞的调控作用

摘 要：［目的］ 观察急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）患者外周血Notch信号通路分子表达和CD4+CD25+CD127dim/-调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）水平,评估Notch信号通路对B-ALL患者Treg活性的影响。 ［方法］ 入组31例B-ALL患者和20名对照者,分选血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,纯化CD4+CD25+CD127dim/- Treg。实时定量PCR法检测PBMC中Notch1~4、Hes1、Hes5 mRNA相对表达量,流式细胞术检测CD4+CD25+CD127dim/- Treg比例,酶联免疫吸附实验检测血浆白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）和IL-35水平。使用Notch信号通路抑制剂GSI刺激B-ALL患者分选的PBMC,检测细胞增殖、Treg比例、IL-10和IL-35表达变化。使用GSI刺激B-ALL患者纯化的Treg,与自体PBMC以1∶10比例共培养,检测细胞增殖、IL-10、IL-35、干扰素-γ水平变化。两组间比较采用独立样本t检验或配对t检验。［结果］ B-ALL患者PBMC中Notch受体（包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）和Notch下游信号分子Hes1、Hes5 mRNA相对表达量均较对照者升高（P<0.001）。B-ALL患者CD4+CD25+CD127dim/- Treg比例高于对照者（8.90%±2.41% vs 4.68%±1.01%,P<0.001）。B-ALL患者外周血IL-10和IL-35水平均高于对照者（P<0.05）。GSI刺激后B-ALL患者PBMC增殖水平与无GSI刺激组差异无统计学意义（P=0.689）,但GSI刺激后Treg比例和IL-10、IL-35水平均较无GSI刺激组降低（P<0.05）。使用GSI刺激Treg后与自体PBMC共培养,其抑制PBMC增殖的能力减弱（P<0.001）,IL-10和IL-35水平减少（P<0.05）,但干扰素-γ水平增加（P<0.001）。［结论］ B-ALL患者外周血中Notch受体表达升高可能诱导CD4+CD25+CD127dim/- Treg数量增加和免疫抑制活性增强。     

Notch signaling in T-cell acute lymphoblastic leukemia

T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a form of pediatric leukemia that is thought to be caused by approximately 12 distinct chromosomal translocations that lead to aberrant expression of as many different cellular genes. Development of novel, rational therapies against such a diverse set of mechanistic targets has thus been a formidable challenge. Recent studies, however, have identified a large fraction of T-ALL cases carrying mutations in one of these genes, Notch1, suggesting for the first time that many cases may share a common pathogenic etiology, and perhaps may allow the development of targeted therapies that benefit the majority of patients with this disease.     

Therapeutic potential of Notch inhibition in T-cell acute lymphoblastic leukemia: rationale,caveats and promises

T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a malignancy that presents with poor prognosis. Treatment relies on the application of aggressive therapies that produce deleterious side-effects, justifying the quest for novel, more efficient and selective molecular targeting agents. Mutations leading to abnormal Notch-1 activity are present in more than half of the T-ALL patients, underscoring the potential therapeutic relevance of targeting Notch-1 inhibition and further reinforcing the need to better comprehend the mechanisms by which Notch-1 drives T cell leukemogenesis. Clinical application of γ-secretase inhibitors to block Notch signaling in T-ALL revealed new challenges that involve improvement of the therapeutic benefit and reduction of intestinal toxicity. Here, we review the latest advances in the development and use of Notch antagonists and summarize the current knowledge on Notch function in T-ALL to understand how it may translate into novel therapeutic strategies that increment the efficiency of Notch inhibition.     

Silencing of Notch3 Using shRNA driven by survivin promoter inhibits growth and promotes apoptosis of human T-cell acute lymphoblastic leukemia cells

BackgroundAs a highly conserved system, the activation of the Notch pathway has been implicated in the tumorigenesis of various hematologic diseases, including leukemias, lymphomas, and multiple myeloma. The Notch3 receptor is frequently expressed in T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL).MethodsTo explore its possibility as a therapeutic target for T-ALL, we investigated the effect of Notch3 silencing on Jurkat and SupT1 cells using a novel tumor-specific short hairpin RNA (shRNA) driven by survivin promoters.ResultsWe found that downregulated expression of Notch3 correlated with significant apoptosis and inhibition of proliferation.ConclusionThese facts suggest that downregulating expression of Notch3 could attenuate the Notch signaling activity in T-ALL. All these results indicate that inhibition of Notch3 expression can result in potent antitumor activity in T-ALL.     

阿帕替尼抑制白血病细胞株Nalm6增殖及诱导凋亡的实验研究

目的 阿帕替尼(Apatinib)为新一代小分子血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)酪氨酸激酶抑制剂,对多种实体肿瘤细胞有杀伤作用.本研究探讨Apatinib对急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞株Nalm6增殖抑制及诱导凋亡的作用.方法 CCK8法检测不同浓度Apatinib对Nalm6细胞的增殖抑制作用,Annexin V/PI法检测不同浓度Apatinib诱导Nalm6细胞的凋亡情况,蛋白质印迹法法检测Apatinib处理后Bcl-2、Bcl-xL和PARP蛋白的表达变化.结果 CCK-8细胞毒性实验结果显示,Apatinib对Nalm6细胞具有明显的增殖抑制作用,呈剂量及时间依赖性,作用48 h后,2.5、5、10、20和40 μmol/L的Apatinib对Nalm6细胞的增殖抑制率分别为(3.78±1.01)％、(13.36±1.42)％、(25.80±2.83)％、(44.40±7.74)％和(64.07±6.66)％,经多个独立样本非参数检验Kruskal-Wallis H分析,各浓度的Apatinib均能诱导Nalm6细胞凋亡,与对照组(3.61±0.91)％比较差异有统计学意义,x2[13.500,P=0.009;作用72 h后,2.5、5、10、20和40 μmol/L的Apatinib对Nalm6细胞的增殖抑制率分别为(4.57+2.38)％、(20.26+4.06)％、(39.27±1.57)％、(65.19±4.45)％和(85.54±3.37)％,经检验各浓度的Apatinib均能抑制Nalm6细胞增殖,与对照组比较差异有统计学意义,x2=13.500,P=0.009.48和72 h的IC50分别为(24.39±0.05)和(13.18±0.08) μmol/L.凋亡实验显示,Apatinib能增加Nalm6细胞凋亡率,并呈剂量依赖性,作用48 h后,对照组和10、20、30、40 μmol/L Apatinib组对Nalm6细胞的凋亡率分别为(3.61±0.91)％、(5.28±1.29)％、(5.9±0.85)％、(10.18±1.48)％和(15.23±3.69)％,经检验各浓度的Apatinib均能诱导Nalm6细胞凋亡,与对照组比较差异有统计学意义,x2=12.433,P=0.014;作用72 h后,对照组和10、20、30、40 μmol/L Apatinib组对Nalm6细胞的凋亡率分别为(3.8±1.10)％、(5.33±2.08)％、(10.10±2.86)％、(12.15±1.43)％和(25.61±3.63)％,经检验各浓度的Apatinib均能诱导Nalm6细胞凋亡,与对照组比较差异有统计学意义,x2 =12.233,P=0.016.蛋白质印迹法结果显示,Apatinib作用Nalm6细胞24、48 h后均能下调Bcl-2和Bcl-xl的表达,切割PARP蛋白.结论 Apatinib能抑制Nalm6细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与下调Bcl-2和Bcl-xl有关.     

RNA interference-mediated silencing of NANOG leads to reduced proliferation and self-renewal,cell cycle arrest and apoptosis in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells via the p53 signaling pathway

NANOG is critical for maintaining the self-renewal and proliferative properties of embryonic stem cells. Here we found that cultured T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cells, as well as human primary T-ALL cells, express a functional variant of NANOG. NANOG mRNA is derived predominantly from a retrogene locus termed NANOGP8. Furthermore, we showed that RNA interference-mediated NANOG knockdown inhibited cell proliferation, reduced self-renewal, promoted apoptosis and arrested the cell cycle through a p53-mediated pathway in leukemic cells. These findings demonstrate the oncogenic potential of this pluripotent gene in human T-ALL cells.     

Notch3-siRNA增强结肠癌细胞对托泊替康的化疗敏感性

目的：探讨下调Notch3表达是否可增强结肠癌SW620细胞对化疗药托泊替康（topotecan）的敏感性。方法：将Notch3siRNA转染到SW620细胞中,Westernblotting检测转染后SW620细胞中Notch3的表达水平。转染后不同时间加入托泊替康,MTr法检测SW620细胞的增殖;Hoechst33342染色和流式细胞仪检测SW620细胞的凋亡;Caspase-3活化试剂盒检测SW620细胞中caspase-3的活化。结果：Notch3siRNA转染可明显抑制SW620细胞中Notch3蛋白的表达;托泊替康作用于Notch3siRNA转染组细胞的IC50较对照CtrlsiRNA转染组显著降低（P〈0．05）;流式细胞仪检测显示沉默Notch3的表达可显著增强托泊替康诱导的结肠癌细胞凋亡（P〈0．05）和caspase-3活化（P〈0．05）。结论：siRNA沉默Notch3的表达可增强SW620细胞对托泊替康的化疗敏感性。     

黄芩苷通过Notch通路对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨黄芩苷能否通过抑制人结肠癌SW480细胞中Notch通路的表达而抑制其增殖并促进其凋亡。方法:MTT法及流式检测术分别检测不同浓度黄芩苷对人结肠癌SW480细胞生长抑制及凋亡的影响；Western Blot法及RT-PCR法分别检测不同浓度黄芩苷对人结肠癌SW480细胞Notch1、Hes-1蛋白和Jagged1基因表达的影响。结果:随着药物剂量的增大，黄芩苷对人结肠癌SW480细胞的抑制率逐步上升；黄芩苷20 μmol/L组细胞凋亡率显著高于对照组；黄芩苷40 μmol/L组细胞凋亡率显著高于黄芩苷20 μmol/L组；黄芩苷20 μmol/L组细胞Notch1、Hes-1蛋白、Jagged1基因表达均显著低于对照组，黄芩苷40 μmol/L组Notch1、Hes-1蛋白、Jagged1基因表达均显著低于黄芩苷20 μmol/L组。结论:黄芩苷能抑制人结肠癌SW480细胞的增殖，促进其凋亡，这种作用可能是通过对细胞中Notch通路的负性调节而实现的。