汉滩病毒S、M基因部分片段嵌合基因原核载体的构建及表达产物的鉴定

目的　将汉滩病毒核蛋白 (NP)主要抗原位点活性片段与囊膜糖蛋白G2进行融合原核表达及鉴定 ,为该融合蛋白的真核表达及汉滩病毒基因工程疫苗研究打基础。方法　构建了汉滩病毒 76 - 118株M基因G2 片段与S基因 5’端70 0bp片段的嵌合片段原核表达载体pGEX - 4T1-G2 S0 7,诱导表达相应的融合蛋白 ,用Westernblotting和ELISA方法进行鉴定。结果　酶切结果显示成功构建了原核表达载体 pGEX - 4T1-G2 S0 7。IPTG诱导表达 4h后 ,Westernblotting显示诱导出分子量约 10 0kD的含GST的融合蛋白 (GST -G2 N0 7)。ELISA结果表明该融合蛋白与抗汉坦病毒NP特异性McAb有较高的结合活性 (P/N值为 0 71/ 0 0 7) ,与抗汉滩病毒糖蛋白特异性McAb也有较弱的结合活性 (P/N值为 0 2 1/ 0 0 8)。结论　S、M基因拼接方式是成功的 ,能够表达出有活性的汉滩病毒G2 糖蛋白与NP片段的融合蛋白。     

汉滩病毒S基因全长和截短片段在大肠杆菌中表达及其初步应用

目的体外克隆表达汉滩病毒全长及部分核蛋白编码基因,筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区,以期获得高质量核蛋白抗原,为研制新型肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）基因工程诊断试剂奠定基础。方法利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒７６－１１８Ｓ基因全长及部分氨基端编码基因（Ｓ、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ和ＳＤ）,分别将各编码基因克隆入Ｔ７原核表达载体,在大肠杆菌中表达;免疫印迹试验（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ）分析重组抗原活性。结果完整和截短核蛋白皆得到有效表达,相对分子质量分别为５００００（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳｐｒｏｔｅｉｎ,ｒＳ）、４５００（ｒＳＡ）、２２０００（ｒＳＢ）、２５０００（ｒＳＣ）和２７０００（ｒＳＤ）,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明截短核蛋白（ｒＳＢ、ｒＳＣ和ｒＳＤ）具有较好的抗原活性;粗提抗原Ｄｏｔｂｌｏｔ方法检测ＨＦＲＳ患者血清结果与ＩＦＡ法一致;重组小片段抗原与抗汉滩病毒单克隆抗体５Ｈ５及Ｈ７可发生特异性反应。结论汉滩病毒核蛋白的氨基端含有一主要抗原决定簇区;原核表达的截短核蛋白在ＨＦＲＳ的血清学诊断中具有一定的价值。     

汉滩病毒核蛋白部分片段与囊膜糖蛋白G1在昆虫细胞中的融合表达

目的　应用Bac -to -Bac杆状病毒表达系统融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白部分片段。方法　构建含有汉滩病毒G1S0 7嵌合基因的杆状病毒表达载体 pFBD -G1S0 7,转化DH10Bac致敏菌 ,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上 ,快速筛选出含有G1S0 7嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达该融合蛋白 ,利用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果　构建的含G1S0 7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出融合蛋白 ,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别 ,表达产物主要集中在细胞内。结论　在昆虫细胞中表达出具有生物学活性的G1S0 7融合蛋白 ,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础     

汉滩病毒核衣壳蛋白主要B细胞表位的识别及其基因定位

目的　确定汉滩病毒核衣壳蛋白（ＮＰ）Ｂ 细胞表位的基因定位。方法　将ＤＮａｓｅ Ⅰ随机消化的汉滩病毒７６／１１８ 株Ｓ基因片段与丝状噬菌体载体连接后转化ＭＣ１０６１ 菌,成功构建了汉滩病毒Ｓ基因多肽片段噬菌体肽库。应用１２ 株国产抗汉滩病毒单克隆抗体对表达汉滩病毒ＮＰ 多肽片段的噬菌体文库进行了３ ～４ 轮淘筛（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ） ,并对阳性噬菌体克隆进行了扩增和测序。结果　确定了Ｓ 基因产物———病毒核衣壳蛋白氨基端的一个Ｂ 细胞线性抗原表位,该表位覆盖ａａ１ａａ８６ 的范围,相当于Ｓ基因ｂｐ３７２９４ ,其核心序列可能由ａａ１５６６ 构成。结论　该线性表位能与多种抗汉滩病毒单克隆抗体发生交叉反应,是汉滩病毒ＮＰ的主要抗原表位。     

汉滩病毒体外诱导热休克蛋白70的表达

目的定量研究汉滩病毒（HTNV）体外诱导细胞热休克蛋白70（HSP70）及HSP70 mRNA的表达规律。方法以HTNV敏感细胞株Vero-E6为对象，体外实验性感染Hantaan 76—118。采用原位杂交、免疫细胞化学染色法及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察感染后72h内HSP70的表达并加以定量分析。结果与模拟感染组相比，Hantaan 76—118感染Vero-E6细胞后0．5h，HSP70 mRNA开始升高，于感染后12h达高峰，并持续高表达至72h（P＜0．05）。Hantaan 76—118感染后2h可检测到HSP70蛋白表达增加，于感染后12h达高峰，并持续高表达至72h（P＜0．05）。结论体外感染HTNV可诱导Vero-E6细胞产生热休克反应并表达HSP70，这种快速、持久的应激反应，可能对HSP70持续发挥其细胞保护作用具有重要意义。     

汉滩病毒结构蛋白与该病毒感染诱导表达的多种热休克蛋白的研究

目的研究汉滩病毒(HTNV)感染乳鼠诱导其脑组织表达热休克蛋白(HSPs)及其与病毒结构蛋白的相互关系。方法选出生2～3d的昆明乳鼠实验性感染HTNV,取感染后8d的乳鼠脑组织制成组织匀浆液,用双特异性抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫共沉淀方法分析病毒核衣壳蛋白(HTNVNP)和囊膜糖蛋白G2(HTNVG2)与94000葡萄糖调节蛋白(GRP94)、HSP70、HSP27三种HSPs的关系。结果HTNV感染乳鼠诱导其脑组织表达GRP94、HSP70;HTNVNP同时与GRP94、HSP70、HSP27相互作用,呈复合物形式存在;HTNVG2也与HTNVNP和HSP27存在相互作用,形成HTNVG2NPHSP27非共价复合物。结论HTNV感染可诱导表达多种HSPs,这些HSPs同时与病毒结构蛋白发生相互作用形成非共价复合物,表明在病毒感染和病毒结构蛋白的合成、转运等过程中有多种HSPs伴侣分子的参与,其相互作用机制有待进一步研究。     

汉滩病毒感染EA.hy926细胞上调固有免疫相关分子表达的研究

目的　探讨汉滩病毒（hantaan virus, HTNV）感染EA.hy926细胞诱导抗病毒固有免疫相关分子的表达,为建立HTNV感染的细胞模型提供依据。方法　将HTNV感染EA.hy926细胞,利用间接免疫荧光和实时荧光定量PCR技术于不同感染时间段,检测EA.hy926细胞中模式识别受体、细胞因子及抗病毒相关分子的mRNA表达水平。结果　HTNV感染EA.hy926细胞后,随着感染时间的持续,核蛋白mRNA相对表达倍数显著上调,且不同感染时间段差异具有统计学意义（P＜0.05）;与未处理组相比,HTNV感染EA.hy926后,Toll样受体3、RIG-I和MDA5模式识别受体mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）,IL-6、IL-10、IFN-β和CCL5细胞因子mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）,ISG15、MxA、OAS1、IFITM1和IFITM3抗病毒相关分子mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）。结论　HTNV感染EA.hy926细胞后,可上调抗病毒固有免疫相关分子的表达,该细胞可以作为体外HTNV感染的细胞模型。     

汉滩病毒核酸疫苗滴鼻免疫小鼠效果的实验

目的　观察汉滩病毒DNA疫苗滴鼻免疫诱导机体产生的免疫应答 ,探索汉滩病毒DNA疫苗新的免疫途径。方法　用重组质粒PcDNA3 1B -S1 3 经滴鼻接种BALB/c小鼠 ,采用ELISA、淋巴细胞转化试验及流式细胞仪等方法检测了其诱导的系统和粘膜免疫反应。结果　免疫小鼠血清IgG及粪便IgA明显增高 (P <0 0 1) ,且IgA增幅较大 ;实验组淋巴细胞增殖反应明显 ,刺激指数 (SI)显著增大 (P <0 0 5 ) ;免疫后CD+ 4 、CD+ 8T细胞均增加 (P <0 0 1) ,而CD+ 4 /CD+ 8T细胞比值无显著变化 (P >0 0 5 )。结论　汉滩病毒重组质粒滴鼻免疫能诱导机体产生了特异的系统免疫和较强的粘膜免疫 ,滴鼻的疫苗免疫途径有着潜在的应用价值。     

汉滩病毒感染与整合素β3表达的相关性

目的　探讨整合素 β3表达与汉滩病毒 (HTNV)感染的关系。 方法　将人整合素 β3、αv及αⅡb真核表达载体分别及共转染至CHO细胞 ,采用间接免疫荧光测定 (IFA)、流式细胞计数(FCM)检测外源基因的表达 ;然后用HTNVA9株感染稳定转染的CHO细胞 ,应用IFA和FCM检测病毒抗原。结果　整合素 β3在共转染组细胞中高效表达 ,且目的蛋白主要定位于细胞膜上 ;β3单转染组目的蛋白虽有一定量的细胞膜表达 ,但表达量低于共转染组 (P <0 0 5 ) ;αv和αⅡb单转染组目的蛋白的表达量明显低于共转染组 (P <0 0 1) ,且定位发生变化。病毒感染率共转染细胞较高 ,CHO/αvβ3和CHO/αⅡbβ3细胞分别为 6 0 1%和 5 5 9% ;未转染 β3的细胞感染率较低 ,CHO细胞仅为 1% ;而单转染 β3细胞介于两者之间 ( 38 7% )。结论　汉滩病毒感染率与整合素 β3表达水平密切相关 ,整合素 β3可以促进HTNV的入胞作用     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达

本文采用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了汉坦病毒陈株的Ｓ基因的编码区序列，克隆入真核表达载体ＰＣＭＶ４，构建了可表达汉坦病毒Ｓ基因的真核表达载体ＰＣＭＶ４－ＣｈｅｎＳ１．３。用电穿孔法转染ＣＯＳ－７细胞，免疫荧光和ＥＬＩＳＡ检测表明，目的基因在ＣＯＳ－７细胞中获得瞬时表达。     

人宫颈癌基因RNA干扰真核表达载体的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

目的:构建针对人宫颈癌基因2(HCCR2)有效靶点的RNA干扰真核表达载体,鉴定获得干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.方法:设计并合成多个针对HCCR2基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体pGCsi-H1/Hygro/NEGative,通过测序和与HCCR过表达载体共转染293T细胞后行West...     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

登革病毒prM基因真核表达载体的构建及在白纹伊蚊细胞C6/36中的表达

目的　构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法　将prM基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并使其表达 ,利用RT -PCR法检测目的基因的转录 ,Western -blot检测融合蛋白的表达。结果　成功构建了 pEGFP -prM重组质粒 ,RT -PCR证明 prM基因在蚊细胞内的转录 ,Western -blot检测到 prM -GFP融合蛋白的表达。结论　成功构建登革了病毒 prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达 ,为进一步研究细胞内免疫的分子机制及构建转基因蚊虫奠定了基础     

丙型肝炎病毒基因片段体外转录和真核表达载体的构建与鉴定

目的 探讨基因免疫和基因治疗用于丙型肝炎病毒（HCV）疫苗及抗HCV感染的可行性，构建含HCV基因片段的体外转录和真核表达载体。方法 从HCV慢性感染患者血清中提取总RNA后，采用逆转录PCR扩增出含有5'NCR和编码核心蛋白C区上游基因片段的HCV－cDNA，经HindⅢ和EcoR I双酶切后，定向克隆入体外转录载体pGEM3ZF(-)和真核表达载体pBBS212中，构建成pGEM3ZF-HCV和pBBS212-HCV重组表达质粒，并经双酶切鉴定。结果 用HindⅢ和Eco R I双酶切鉴定证实，克隆的HCV基因片段正确插入载体pGEM3ZF(-)和pBBS212中。结论 成功构建含5'NCR和部分核心C区基因的体外转录及真核表达载体，可为进一步研究HCV基因疫苗以及核酶基因治疗HCV奠定基础。     

乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达.方法用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子,载入T载体,测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1,构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体,经酶切、测序鉴定各重组体.采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2,用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达.结果各目的片段测序正确并成功插入表达载体中,转染了各质粒的阳性细胞克隆均可检测出EGFP的表达,不同启动子调控下的蛋白表达量有所不同. 结论HBV启动子调控下的EGFP报告基因能够在肝癌细胞中特异表达,不同启动子表达效率之间存在一定的差异性,从而为肝脏疾病的基因治疗提供了一个新的选择.     

Construction of eukaryotic expression plasmid containing HCV NS3 segment and protein expression in human HL-7702 hepatocytes

AIM:To construct the eukaryotic expression plasmidcontaining HCV NS3 segment and to analyze theexpression of NS3 protein in normal human hepatocyteHL-7702.METHODS:We amplified HCV NS3 fragment fromplasmid pBRTM/HCV 1-3011 containing the whole lengthof HCV genome,recombined it with expression vectorpcDNA3.1(-)to form the eukaryotic expression vectorpcDNA3.1(-)/NS3,and transfected human HL-7702hepatocytes with the recombined plasmid by cationicpolymers.The expressed HCV NS3 protein was detectedand analyzed by immunohistochemical method andWestern blot.RESULTS:The amplified NS3 fragments had correctmolecule weight and sequence.The successfullyconstructed eukaryotic expression plasmids weretransfected to HL-7702 cells.The expressed NS3 proteinshad correct molecular weight 70000.CONCLUSION:Eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/NS3 containing NS3 segment of HCV can beconstructed,the sequence of NS3 fragments is consistentwith the template.Normal human HL-7702 hepatocytescan efficiently express specific HCV NS3 protein in vitro.     

汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码核蛋白的S基因,将扩增产物分别与pGEM-T-Easy载体连接,经序列分析后双酶切,分别定向克隆入载体pPICZαΑ和pPICZαC,继而将重组质粒以SacⅠ线性化并电转化入毕赤酵母X33感受态细胞,用Zeocin筛选高拷贝转化子进行鉴定。结果PCR扩增产物约为1290bp,与T载体相连测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.84%和99.92%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆获得pPICZα-ΑZ10S和pPICZ-αL99S,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10S和PpX33-L99S,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HIN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体并分析插入的M2基因序列。方法从接种人流感病毒株A／PR／8／34（H1N1）的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用特异引物进行RT-PCR，扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段克隆入真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）。经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的M2基因序列进行分析。结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。序列分析有4个氨基酸出现变异，提交Genbank进行Blast比对显示同源性97％（Genbank／NCBI AY768951）。结论M2四聚体蛋白具有H^＋通道功能，能够协助病毒与宿主细胞膜融合后释放RNP复合体，还能稳定HA蛋白的结构。M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口。该结果将为甲型流感病毒基因工程疫苗，通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

乙型肝炎病毒S基因重组逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达

目的 探索逆转录病毒载体在基因治疗中的应用。方法 用ＤＮＡ重组技术构建ＨＢＶ－Ｓ基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染ＰＡ３１７后,筛选高表达克隆,用假病毒颗粒感染ＨｅｐＧ２、Ｐ８１５和ＥＬ４细胞,分别用ＲＴ－ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ法检测目的基因表达。结果 ＨＢｓＡｇ在上述细胞中获得不同程度的表达,细胞上清液（４８ｈ）中ＨＢｓＡｇ含量（吸光度值）分别为０．９２、０．０９和０．４７。结论 逆转录病毒用载体,     

不同结合臂长10-23 DNAzymes对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用

目的探讨不同结合臂长10-23DNAzymes在2．2．15细胞内对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用。方法设计并合成不同结合臂长的10-23 DNAzymes,能分别针对乙型肝炎病毒S基因和C基因开放阅读框A^157UG和A^1816UG。不同的10-23 DNAzymes分别转染2．2．15细胞,放射免疫分析法测定2．2．15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平,实时荧光定量PCR法测定2．2．15细胞培养上清中HBVDNA水平。MTT法检测细胞毒性。结果不同结合臂长的10-23 DNAzymes在0．1—2．5μmol／L浓度范围内均能有效抑制HBsAg和HBeAg的表达,抑制效应可长达72h。在同一剂量相同转染时间的条件下,不同结合臂长的10．23 DNAzymes对HBsAg和HBeAg表达的抑制率呈以下关系：DrzBS-9〉DrzBS．8〉DrzBS-7;DrzBC-9〉DrzBC．8〉DrzBC-7。DrzBS-9和DrzBC-9在2．5~mol／L剂量条件下,转染48h后对HBsAg和HBeAg表达的抑制率可分别高达95％和92％。不同结合臂长的10-23DNAzymes对2．2．15细胞培养上清中HBVDNA水平并无明显影响。MTT细胞毒性检测表明,在0．1～2．5μmol／L浓度范围内未见10-23 DNAzymes对2．2．15细胞的毒性作用。结论不同结合臂长10-23 DNAzymes在2．2．15细胞内对乙型肝炎病毒s基因和c基因表达均有一定的抑制作用,DrzBS-9和DrzBC-9的抑制作用较强。