改良PHEMA一体化人工角膜植入碱烧伤兔角膜的实验研究

[目的]评价改良聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)一体化人工角膜对碱烧伤兔角膜的治疗效果.[方法]通过两阶段化学聚合结合车床机械切削合成改良的一体化PHEMA人工角膜.将饱和有1mol/L NaOH滤纸烧伤兔角膜中央,来建立稳定碱烧伤兔眼模型.实验分两部分完成.第一部分将PHEMA海绵边裙材料植入10只正常兔角膜板层间,术后2周、4周、2个月、3个月、4个月分别行光镜和电镜检测,观察海绵材料中细胞和新生血管的生长情况.第二部分10只碱烧伤兔眼角膜囊袋内Ⅰ期植入一体化PHEMA人工角膜,术后临床观察材料与组织的愈合情况;术后2～3个月Ⅱ期手术切除中央前板层角膜组织,暴露人工角膜中央镜柱,术后随访3个月,初步观察临床治疗效果.[结果]兔角膜碱烧伤3个月,形成带有新生血管的角膜白斑模型.10只正常兔角膜均接受板层间植入术,随访期间未见任何并发症光镜下,PHEMA海绵术后2周开始有成纤维细胞长入,术后2～3个月多量细胞长入的同时伴有新生血管生长;电镜下,细胞在海绵材料间隙中生长,细胞生长状态良好,并有部分细胞外基质和胶原的存在.10只碱烧伤兔眼接受人工角膜移植术,其中1眼Ⅰ期术中角膜穿孔而被排除,9眼接受Ⅱ期手术;Ⅱ期术后,3眼2周内人工角膜镜柱偏位,6眼观察期间未见人工角膜脱位;这6眼中,2眼观察期间镜柱透明未见任何并发症,3眼出现不同程度镜柱前表面纤维增生组织遮盖,1眼镜柱中央轻度钙化.[结论]PHEMA人工角膜能够与角膜组织达到良好的生物学愈合;多孔边裙的强度需要进一步加强,以便减少中央镜柱脱出的发生率.     

兔角膜植入改性HEMA人工角膜支架材料的实验研究

目的：评价兔角膜层间植入改性聚羟乙基丙烯酸甲酯[poly(2-hydroxyethyl methacrylate),PHEMA]孔隙性材料的生物学反应。方法：选用新西兰白兔，将材料植入角膜板层口袋内，定期观察。结果：植入后材料全部稳定存留于角膜内，现最长达6个月以上。未见材料排出、白内障、视网膜脱离、角膜后膜等并发症。术后并发症包括睑缘红肿，畏光，流泪等刺激症状，均于术后1周内消失；组织学提示材料孔隙内有多量的成纤维细胞并有胶原等细胞外基质沉积。电镜检查材料周围角膜细胞数量增多，排列规则，功能活跃；材料内见有纤维细胞，类似正常的组织愈合过程。结论：结果提示此新忆隙材料是人工角膜支架的理想材料；由于该材料还可以制作成光学性能良好的光学部，故可望制成一体式人工角膜。     

干眼模型兔角膜层间植入PHEMA、PMMA后角膜组织学及超微结构的改变

目的观察微孔聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯[Poly(β-hydroxyethyl methacrylate)],PHEMA和微孔聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)材料植入干眼模型兔角膜层间后引起的组织学和超微结构的改变,评价这两种材料的生物相容性,为进一步的研究提供依据。方法干眼模型兔12只,随机分为2组,分别在右眼造模眼的角膜层间植入微孔PHEMA、微孔PMMA材料,分别于术后0.5月、1月、2月处死动物,行HE染色光学显微镜检查和透射电镜检查。结果实验兔的眼部刺激症状,均在术后短期内迅速缓解;术后0.5月,材料的孔隙内可见少量长梭形的角膜基质细胞和成纤维细胞;术后2个月,角膜基质细胞和成纤维细胞继续长入材料的孔隙内并向材料的中心迁徙,同时合成胶原纤维。结论微孔PHEMA、微孔PMMA材料植入干眼模型兔角膜层间后对组织刺激性较小,具有良好的生物相容性。     

干眼模型兔角膜层间植入PHEMA、PMMA后角膜组织学及超微结构的改变

目的观察微孔聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯[Poly（β-hydroxyethyl methacrylate）]，PHEMA和微孔聚甲基丙烯酸甲酯（polyrnethyl methacrylate，PMMA）材料植入干眼模型兔角膜层间后引起的组织学和超微结构的改变，评价这两种材料的生物相容性，为进一步的研究提供依据。方法干眼模型兔12只，随机分为2组，分别在右眼造模眼的角膜层间植入微孔PHEMA、微孔PMMA材料，分别于术后0．5月、1月、2月处死动物，行HE染色光学显微镜检查和透射电镜检查。结果实验兔的眼部刺激症状，均在术后短期内迅速缓解；术后0．5月，材料的孔隙内可见少量长梭形的角膜基质细胞和成纤维细胞；术后2个月，角膜基质细胞和成纤维细胞继续长入材料的孔隙内并向材料的中心迁徙，同时合成胶原纤维。结论微孔PHEMA、微孔PMMA材料植入干眼模型兔角膜层间后对组织刺激性较小，具有良好的生物相容性。     

细菌纤维素构建组织工程角膜基质的方法及其评价

目的：探讨以细菌纤维素(BC)为支架构建组织工程角膜基质的可行性。方法： 体外分离培养兔和人角膜基质细胞,种植到BC膜中,构建完成后进行兔和人角膜基质细胞-BC复合膜的生物检测,并将兔角膜细胞生物复合物进行同种异体移植。术后1、4和8周时分别活体行前节OCT、角膜共焦显微镜检查,离体后组织学及免疫组织化学检查。结果： 人和兔角膜基质细胞长入BC的网架结构,细胞生长状态良好。移植术后1周兔眼无炎症反应及新生血管,4周后植片边缘出现新生血管,表面无水肿及溃疡形成。术后8周角膜共焦显微镜显示：移植片周围基质细胞增生活跃,邻近的角膜内皮细胞数量和形态正常。前节OCT显示：移植后复合膜逐渐降解,4周时复合膜边界模糊,8周时密度接近正常角膜组织。离体组织学检查显示：BC复合膜与正常角膜基质相似,有炎细胞浸润和血管形成,角膜组织无坏死和溶解。结论： BC无细胞毒性,具有良好的组织相容性和可降解性,可作为构建组织工程角膜基质的生物支架。     

异种角膜缘上皮移植治疗碱烧伤动物的实验研究

[目的]观察异种角膜缘上皮早期移植对兔角膜碱烧伤的治疗效果。[方法]用鲤鱼角膜作异种角膜缘上皮移植的角膜来源，对角膜缘碱烧伤的兔动物模型进行异种角膜缘干细胞上皮移植术，观察术后新生血管长入角膜的情况以及基质中的炎症反应。[结果]异种角膜缘上皮移植术后，植片与植床粘附良好，基质中细胞浸润减轻，新生血管长入减少，实验组与对照组之间存在显著差异。[结论]异种角膜缘干细胞上皮移植术治疗角膜碱烧伤可减少角膜新生血管的形成，维持角膜缘的细胞屏障功能。     

兔角膜板层植入PHEMA人工角膜支架的实验研究

目的 通过体内实验研究聚甲基丙烯酸－β－羟乙酯（poly2-hydroxyethl methecylate,PHEMA)人工角支架与角膜的生物愈合特性，并比较两种不同孔径大小的材料中角膜组织生长情况。方法 将直径6mm，厚0.2mm，孔径50－100μm及100－150μm的PHEMA圆形薄片植入兔角膜层间，分别于半月，1个月，2个月进行光镜和电镜检查。结果 术后1月胶原纤维及角膜成纤维细胞即可长入PHEMA微孔中，未见组织溶解，坏死及植入物脱出。孔径50－100μm的支架内胶原纤维比孔径100－150μm的支架多。结论 PHEMA具有良好的生物相容性，孔长50－100μm的支架比孔径100－150μm的支架更易于角膜组织愈合。     

生物活性玻璃作人工角膜周边材料的研究

目的：探讨生物活性玻璃作人工角膜周边材料的效果。 方法：将孔隙率为 ４２ ％ 的 Ｃａ Ｏ Ｐ２ Ｏ５ 系列生 物活性玻璃制成直径为 ６ ｍ ｍ ,内曲率为 ７０ ｍ ｍ ,外曲率为 ７５ ｍ ｍ ,厚度为 ０５ ｍ ｍ 的人工角膜周边支架植 入 １０ 只兔角膜 中（均为右眼）,最长的植入期为 ７ 个月。结果：均未发现兔角膜出现肿胀、角膜溃疡、角膜细胞 坏死的现象,表明生 物活性玻璃与角膜 组织有良好的生 物相容性,扫描电镜 结果也表明角膜 组织能长入生物 活性玻璃的孔隙中,结论：生物活性玻璃起到固定角膜的作用和促进角膜生物愈合的作用。     

角膜缘上皮细胞与脱细胞角膜材料移植修复碱烧伤角膜的实验研究

目的 探讨应用角膜缘上皮细胞(limbal epithelial cells,LECs)及脱细胞角膜材料(decellularized porcine cornea,DPC)移植修复碱烧伤兔角膜的疗效.方法 培养同种异体兔LECs,鉴定其中的角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),制备DPC作为支架材料,将LECs和DPC两者复合培养后板层移植到碱烧伤的兔眼角膜,观察移植后4个月内的角膜修复情况.结果 免疫细胞化学及RT-PCR检测培养的LECs中有表达ABCG2的LSCs.大体观察LECs-DPC移植后碱烧伤角膜的混浊度减轻,新生血管消退.HE、Masson Trichrome染色显示移植后上皮面的细胞复层化生长,炎性细胞浸润减少,DPC纤维整合于碱烧伤的角膜植床,角膜胶原排列趋于规则.透射电镜检查有桥粒及微绒毛结构形成.结论 体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞联合脱细胞角膜材料移植能够修复碱烧伤的兔眼角膜.     

脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

 目的 探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）为支架,复合自体脂肪干细胞构建组织工程角膜基质修复角膜基质层缺损的可行性。方法 兔脂肪干细胞（rabbit adipose derived stem cells,rASCs）培养至第4代接种在PLGA载体支架上,扫描电镜观察细胞在支架上生长黏附情况。体外培养7天后将rASCs-PLGA复合物回植到角膜基质缺损模型的兔角膜基质层间,术后第12周和24周取材行组织学和透射电镜超微结构观察。未接种细胞的PLGA材料移植基质层间作为对照组。结果 细胞在PLGA支架上生长增殖良好,实验组移植术后12周材料降解,角膜基本恢复透明。组织学检查显示移植后24周新生角膜基质样组织与正常角膜基质组织相似,电镜下胶原纤维直径与正常角膜基质组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 脂肪干细胞可作为种子细胞来源用于构建组织工程角膜基质。     

人工角膜设计及应用实验研究

目的观察两种直径的人工角膜在兔角膜应用的生物学反应。方法两种人工角膜均由光学中心和周边支架组成。23只人工角膜分两组植入兔角膜并观察6个月以上。术前人工角膜经rf-argon-plas-ma处理并进行细胞培养。结果最佳人工角膜的直径是4．5～6mm。植入28d后纤维细胞迁徙入多孔的周边支架并有胶元蛋白沉积。组织学分析证实,6w后GAG和生长因子沉积在周边支架。结论rf-argon-plasma处理可增加材料的组织相容性,上皮细胞可迁徙至人工角膜的光学中心。     

组织工程支架材料——交联透明质酸置入角膜生物相容性研究

目的探讨交联透明质酸材料对兔角膜组织的生物学反应的影响,评价其作为角膜组织工程支架材料的可行性。方法将交联透明质酸材料置入兔角膜基质层间内3个月,观察置入材料在角膜内生物学反应。结果观察期内交联透明质酸材料与兔角膜基质愈合良好,角膜组织学观察未见有淋巴等炎症细胞浸润。结论交联透明质酸材料置入兔角膜后无明显炎症反应,其生物相容性良好,是一种理想的角膜组织工程支架材料。     

自体MSC移植修复兔角膜碱烧伤的研究

目的:观察中度角膜碱烧伤后自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后受损角膜的形态学变化,探讨BMSCs可能的修复作用。方法:体外分离培养得到BMSCs,生物学鉴定。制备中度角膜碱烧伤模型,移植后28d观察角膜透明度、角膜新生血管(CNV)。结果:兔BMSCs呈长梭形的成纤维细胞样形态。高表达CD29,低表达CD34。碱烧伤后裂隙灯下观察见符合中度角膜碱烧伤模型:角膜上皮剥脱,基质轻度浑浊,角膜缘缺血<1/2,球结膜水肿,虹膜细微结构窥不清楚。BMSCs移植后28d时实验组角膜较对照组透亮,新生血管面积减少。结论:兔角膜碱烧伤后行自体MSC一定程度上抑制了角膜新生血管的生长,促进受损角膜愈合。     

诱导型一氧化氮合酶表达与兔角膜碱烧伤新生血管的关系

目的研究诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在兔碱烧伤角膜的表达与角膜新生血管形成的关系。方法将33只家兔分为正常组（3只,6眼）、烧伤组（30只,60眼）,以2mol/LNaOH制备双眼角膜重度碱烧伤模型,用裂隙灯图像分析系统记录角膜新生血管（CoNV）生长情况。碱烧伤组分批（n=5）于伤后第1、4、7、14、21、28天处死家兔,分别取角膜组织行病理学检查和iNOS的免疫组织化学检测。结果iNOS在正常兔角膜上皮层及基质层仅有少量表达,在烧伤组表达明显增强（P〈0.05）,表达范围主要在基质层炎性细胞、角膜上皮细胞及新生血管内皮细胞,表达峰值在术后第7天,随后下降,在第21天时又有所回升。结论碱烧伤后角膜组织中iNOS的表达明显增加,其变化趋势与碱烧伤后角膜新生血管的生长曲线相一致且高峰期提前2～3d,提示iNOS水平与无菌性炎症性新生血管形成有明显的相关性。     

交联透明质酸植入角膜超声生物显微镜观察

目的探讨交联透明质酸材料对兔角膜组织的生物学反应影响,评价其作为角膜组织工程支架材料的可行性。方法将交联透明质酸材料植入兔角膜基质层间内3个月,超声生物显微镜观察该材料在角膜内生物学反应。结果观察期内交联透明质酸材料与兔角膜基质愈合良好,超声生物显微镜检测到兔眼角膜中间有一高回声条带,随着观察时间延长,角膜中央高回声条带有减弱。结论交联透明质酸材料植入兔角膜后无排异等反应发生,材料逐渐降解吸收,其生物相容性良好,是一种理想的角膜组织工程支架材料。     

Avastin对碱烧伤角膜内新生淋巴管和血管形成的影响

目的观察小鼠碱烧伤后角膜新生淋巴管和血管的形成情况,探讨Avastin对小鼠角膜新生淋巴管和血管形成的影响及其机制。方法制作小鼠角膜碱烧伤模型,随机分为治疗组和对照组,治疗组小鼠25 mg/mL Avastin 5μL结膜下隔日注射,同时左氧氟沙星滴眼液滴眼3次/d,连续治疗两周;对照组连续两周内每日左氧氟沙星滴眼液滴眼3次,分别于碱烧伤后3 d、7 d和12 d取材。应用LYVE-1标记淋巴管,观察小鼠角膜内新生淋巴管的形成情况;体视显微镜观察角膜新生血管形成情况。免疫组化法检测血管生成因子VEGF-C在角膜碱烧伤后不同时间段角膜组织内的表达。结果碱烧伤后7d的对照组角膜基质中可见新生淋巴管。在治疗组中,碱烧伤后12d可见角膜基质内存在新生的淋巴管。Avastin治疗组不同时间段角膜新生血管的形成均少于角膜碱烧伤对照组。在正常小鼠角膜组织内,VEGF-C表达于角膜上皮层和内皮层。在治疗组碱烧伤角膜内,各时间段VEGF-C的表达均低于对照组。结论 Avastin具有抑制小鼠角膜碱烧伤后角膜新生淋巴管和新生血管形成的作用,其机制可能是通过抑制角膜组织内VEGF-C的表达从而抑制角膜新生淋巴管和新生血管的形成。     

利用表皮干细胞治疗兔角膜缘干细胞缺损

目的利用自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞在体外构建双层组织工程角膜,并修复兔角膜缘干细胞的缺损.方法建立兔角膜缘干细胞缺损模型,以去细胞猪角膜基质片作为支架材料,以自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞作为种子细胞,在体外构建组织工程角膜,并用来修复兔角膜缘干细胞缺损.结果利用自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞复合异种去角膜基质片在体外成功构建组织工程角膜;构建的组织工程角膜与正常角膜相似,具有上皮层和基质层;用组织工程角膜修复兔角膜缘干细胞缺损3个月后,损伤角膜透明度恢复良好,组织学结构基本恢复正常.结论成功构建了兔的双层组织工程眼角膜,并修复了兔角膜缘干细胞缺损.     

重组人角质细胞生长因子-2对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用

目的: 研究外用旋滴重组人角质细胞生长因子-2（KGF-2）对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用,为角膜上皮损伤的早期治疗探索新方法。 方法: 制备兔角膜碱烧伤模型,60只日本大耳白兔随机分为碱烧伤对照组和KGF-2组（25 mg/L）(n=30);各组日本大耳白兔于造模后以50 μL药物滴眼,每日3次。7和14 d裂隙灯观察角膜烧伤面积以及角膜新生血管的形成,MTT法检测角膜上皮细胞活性,免疫组化方法进行病理组织学检查。结果：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组角膜烧伤面积小于碱烧伤对照组,差异有显著性（P<0.01）。碱烧伤对照组7 d角膜新生血管发生率为17.50%,KGF-2组为7.32%;碱烧伤对照组14 d角膜新生血管发生率为41.67%,KGF-2组为32.5０%。MTT检测结果显示：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组492 nm吸光度与碱烧伤对照组比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。碱烧伤后7和14 d,病理切片HE染色显示：对照组角膜基质水肿,板层纤维排列松散、紊乱,炎症反应反复出现,角膜上皮层变薄,部分脱落,角膜内皮层内侧有大量成纤维细胞增生;KGF-2组碱烧伤后7 d,角膜上皮细胞生长良好,基质轻度增厚,无明显的炎症反应;碱烧伤后14 d,未出现炎症复发,角膜上皮细胞生长良好,排列整齐,角膜基质仅有轻度增厚。结论：外用旋滴25 mg/LKGF-2可加速角膜上皮损伤的恢复,减轻角膜烧伤的各种炎症反应症状;减轻角膜基质水肿和纤维化,同时KGF-2 亦表现出显著的抑制角膜新生血管形成的作用;KGF-2有可能成为另一个对角膜上皮损伤具有重要调控作用的生长因子。     

兔眼碱烧伤后VEGF的表达与角膜新生血管的关系探讨

目的:研究兔眼碱烧伤后角膜血管内皮生长因子(VEGF)的表达与角膜新生血管(CNV)的关系。方法:56只兔随机分成实验组A、实验组B、实验组C及对照组。实验组用N aOH碱烧伤法诱导CNV模型,按碱烧伤后24h、3d、1周、2周、3周、4周,2月、6月处死兔取出角膜,进行CNV的形态学检查及免疫组化法评价VEGF的表达。结果:实验组兔碱烧伤后1d开始出现CNV,2周达高峰;碱烧伤后1d出现VEGF表达,持续升高至碱烧伤后1周,随后表达水平开始下降。对照组中未出现CNV及VEGF不表达。结论:碱烧伤后兔眼VEGF的表达与CNV的形成有密切相关性,并发挥了作用。     

大鼠角膜碱烧伤后黏附分子变化的研究

目的 探讨大鼠角膜碱烧伤后不同时期ICAM-1、VCAM-1和CD44在角膜的表达和分布，了解与角膜碱烧伤病理损害的关系，完善角膜碱烧伤免疫机制的研究。方法 Wistar大鼠80只，制备角膜中度碱烧伤动物模型。分别于角膜碱烧伤后8h、1天、3天、1周、2周、4周、7周处死大鼠，分别采用链酶亲和素-过氧化物酶法（SABC法）和RT-PCR方法检测大鼠角膜局部ICAM-1，VCAM-1和CD44的表达。结果 碱烧伤3天组角膜上皮细胞ICAM-1和VCAM-1呈强阳性，角膜上皮细胞和角膜缘的毛细血管内皮细胞CD44呈中度阳性。2周组角膜上皮细胞ICAM-1表达减弱，基质细胞仍呈强阳性，角膜上皮细胞、基质细胞和基质内新生血管内皮细胞VCAM-1和CD44呈中度表达。碱烧伤3天组ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达量增加，差异显著，CD44 mRNA表达量无显著变化。碱烧伤2周组ICAM-1 mRNA量均较3天时明显减少，两者有显著差异（P〈0．01），VCAM-1 mRNA表达量增加，比3天时增多，同正常对照组相比差异极显著（P〈0．001），CD44 mRNA表达量增加，同正常对照组相比差异显著（P〈0．01）。结论 ICAM-1、VCAM-1和CD44在角膜碱烧伤的不同阶段其表达不同。急性期ICAM-1和VCAM-1的抗原表达和mRNA合成增加，说明角膜碱烧伤的炎性反应重，预后差。随病程延长，CD44 mRNA表达量逐渐增加，证明CD44及其配体在角膜碱烧伤的愈合过程中发挥重要作用。