卡介苗中PE和PPE家族蛋白B细胞抗原表位多态性研究

目的 了解13株卡介苗(bacille calmette-gurin, BCG)基因组中由PE/PPE基因家族编码的B细胞抗原表位分布情况, 分析其对BCG免疫保护力的潜在影响。方法 从国际免疫表位数据库(Immune Epitope Data base, IEDB)中检索结核分枝杆菌B细胞抗原表位, 与结核分枝杆菌参考菌株H37Rv的蛋白质组进行序列比对, 确定PE/PPE基因家族编码B细胞抗原表位序列;并与13株BCG基因组进行序列比对, 提取表位编码序列, 分析其在BCG中的分布与变异。结果 6个PE/PPE基因家族的基因编码28个B细胞抗原表位, 21个B细胞抗原表位在13株BCG中高度保守, 7个B细胞抗原表位在BCG中发生基因变异, 变异表位分别产生于BCG的不同形成期。结论 PE/PPE基因家族所表达的蛋白大多为细菌表面蛋白, PE/PPE蛋白家族中B细胞抗原表位的变化可能对BCG的保护力产生影响, 应继续开展基于B细胞表位的BCG遗传特征研究。     

结核分枝杆菌中假设蛋白抗原表位的多态性研究

目的 探究中国结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株中8个免疫相关的保守性假设蛋白Rv1158c、Rv1461、Rv1977、Rv2182c、Rv3207c、Rv3333c、Rv3378c和Rv3714c人T细胞表位的多态性。方法 选取151株我国临床分离到的结核分枝杆菌菌株,对8种抗原基因进行PCR扩增,并运用Bioedit软件进行序列比对,比较其人T细胞表位的多态性。结果 在151株菌株中,除了Rv1977外其余7个蛋白都表现保守,这与Comas等的研究结果一致。而Rv1977表现了一定的多态性,发生了3个异义突变和一个单碱基的缺失。在Rv1977中的3个T细胞抗原表位中有1个表位发生了变化。结论 结核分枝杆菌中的8个与免疫相关的保守性假设蛋白的T细胞抗原表位中,大部分是保守的,只有Rv1977蛋白具有多态性,这种多态性可能反映了这个抗原参与了逃避宿主免疫的分化选择。     

结核分枝杆菌抗原PE35和PPE68基因多态性的初步研究

目的为研究结核分枝杆菌RD1区编码PE/PPE蛋白家族中的PE 35和PPE 68基因的多态性,并评估其基因多态性对免疫识别的影响。方法笔者从本实验室保存的来自国内不同地区的2346株结核分枝杆菌复合群临床分离株中,选取代表不同Spoligotyping类型的161株临床分离结核分枝杆菌菌株,基因扩增后进行序列比对,比较其在T细胞抗原表位的差异。结果在161株菌株中,23株显示有PE 35基因多态性,8株有PPE 68基因多态性。在PE 35基因中,除了菌株JL06018的突变外的其余突变都导致其T细胞抗原表位的改变。PPE 68基因中,62个T细胞表位中有58个(占93.5%)发生了改变。非北京家族PE 35基因的突变率明显高于北京家族(P0.05),而PPE 68基因突变虽是非北京家族高于北京家族,但差异无统计学意义。结论 PE 35和PPE 68的编码基因存在明显的多态性,并很有可能导致蛋白功能的明显改变。此外,这2个蛋白的人类T细胞表位是高度可变的,提示这2种蛋白可能通过参与分化选择来逃避宿主免疫。北京家族可能比非北京家族更容易被宿主T细胞识别,进而更容易传播。     

中国莱姆病螺旋体菌株OppA2基因中人B细胞表位多态性分析

目的 研究中国莱姆病螺旋体菌株中OppA2基因及其人B细胞抗原表位区的序列多态性,了解不同地域OppA2的变化特征,为中国莱姆病的早期诊断提供线索和依据。 方法 选取59株莱姆病螺旋体分离株,PCR扩增其OppA2基因并测序后,结合3种基因型参考菌株序列,与免疫表位数据库（IEDB）中查询到的B细胞表位序列进行比对分析。 结果 中国莱姆病螺旋体中OppA2基因序列在Borrelia burgdorferi sensu strict（B.b.s.s）, Borrelia garinii（B.g）和Borrelia afzelii（B.a）3个基因型间存在明显的多态性。 但OppA2基因序列在B.b.s.s和B.a型内保守;在B.g型内存在异义突变。 B细胞表位改变主要发生在B.g基因型的亚簇2、亚簇3以及JC2-2分离株。 B.g基因型的亚簇2、亚簇3以及JC2-2菌株的296aa变异和亚簇3的295aa变异使3个B细胞抗原表位受影响;JC2-2菌株的372aa变异使1个B细胞抗原表位受影响;这些表位区的变异使部分B细胞表位序列（4/7,57.1%）呈现多态性。 结论 中国莱姆病螺旋体OppA2基因及其人B细胞抗原表位区在3个基因型间和B.g型内存在多态性;其中有3个B细胞抗原表位区（191～225aa、276～290aa和381～400aa）在B.b.s.s,B.g和B.a三种基因型内高度保守,可作为中国莱姆病早期诊断的候选抗原。      

中国部分地区159株结核分枝杆菌临床分离株MLVA-19分型分析

目的初步了解中国部分地区结核分枝杆菌临床分离菌株数目可变串联重复序列（variable number of tandem repeats,VNTRs)基因多态性特征。 方法采用多位点VNTRs分析（multiple loci VNTRS analysis, MLVA）技术,随机选取159株中国部分地区结核分枝杆菌临床分离菌株,PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,对结核分枝杆菌的19个VNTRs位点进行检测,用BioNumerics (Version 5.0) 软件进行结果分析,数据结果与国际MLVA数据库（http://minisatellites.u-psud.fr）比对,初步分析结核分枝杆菌DNA 多态性特征。结果159株菌株大致被分成4个主要的簇,其中73.8%的菌株为北京家族菌株,其次为H37Rv相似菌株及在数据库中没有比对结果的一簇,这一簇的MLVA特点是ETRD3,MIRU10、MIRU27、MIRU39、MIRU40及Mtub21位点结果为22221,与其他簇的菌株结果有比较明显的区别。可能是中国特有的菌株。另外发现与BCG相似的一簇。结论本次研究中的中国结核分枝杆菌具有明显的VNTR基因多态性,主要流行菌株为北京家族菌株,可能存在中国特异的VNTR基因型。BCG临床分离株的发现,提示BCG疫苗相关病例可能成为值得关注的卫生问题。     

非结核分枝杆菌临床株rpoB基因多态性分析

目的分析常见非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)临床株rpoB基因的多态性。方法提取NTM标准菌株和临床菌株的DNA,扩增其rpoB基因部分序列并进行多态性分析。结果 10种共27株NTM临床株中有8种共14株的rpoB基因存在多态性位点,其中脓肿分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中均发现3个多态性位点。结论NTM临床菌株的rpoB基因存在多态性,是否会影响其在NTM分子鉴定中的应用仍需进一步研究。     

荆州地区HPV-52型E7基因多态性分析和T细胞表位预测

目的研究湖北荆州地区人乳头瘤病毒52型(HPV-52)E7基因变异特征以及预测T细胞表位。方法扩增HPV-52阳性样本E7基因,测序并与GenBank参考序列比对,分析序列变异性,构建E7基因系统发育树,估算基因选择压力以及预测E7蛋白T细胞表位。结果 HPV-52 E7基因突变序列中检测到19个单核苷酸突变,包括10个非同义突变和9个同义突变。常见的单核苷酸突变为751C>T和801A>G,突变率分别为96.51%和98.84%。3个非同义突变发生在编码E7蛋白β折叠区域内。系统进化分析表明荆州地区HPV-52 E7基因变异序列主要分布在B谱系。对于HLA-A*02:01,MLLGTLQVV(84-92)表位亲和力最强,对于HLA-DQA1*01:01/DQB1*02:01,ATIKDYILDLQPETT(6-20)表位亲和力最强。结论湖北荆州地区HPV-52 E7基因序列具有多态性,单核苷酸突变的发现以及T细胞表位预测可为HPV治疗性疫苗的研究提供科学依据。     

耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上新的突变位点

目的:分析耐左氧氟沙星结核分枝杆菌临床菌株gyrA基因的突变情况及其耐药机制.方法:用聚合酶链反应(PER)和DNA直接测序技术(DS)测定64株耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因的QRDR(quinolone resistance-determining regions)序列.结果:64株耐药菌株有47株QRDR序列发生突变,其中45株为单位点突变,另2株为双位点突变;突变分布为70位突变2株、89位1株、90位12株、91位4株、94位30株,其中70位和89位为新发现的突变位点.结论:结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐受现象与gyrA基因QRDR的突变有关,包括新发现的70位和89位突变.     

重庆市南川地区HPV31E6基因多态性研究

目的研究重庆市南川地区人乳头瘤病毒(HPV)31E6基因多态性,为HPV疫苗设计和HPV防治提供依据。方法采用PCR扩增和导流杂交技术检测HPV31阳性患者宫颈脱落细胞HPV31 E6基因,通过测序并与参考序列对比寻找变异位点。使用ProPred-Ⅰserver和ABC pred server分析HPV31 E6蛋白的二级结构并寻找理想的B细胞免疫表位。结果与参考序列HPV31 REF对比,40株HPV31病毒株中,与参考序列E6基因完全一致的病毒株为10株,占25.0%;HPV31 E6基因突变株14株,占35.0%,其中非同义突变6个,同义突变8个,主要的非同义突变为C520T(A138V)和C285T(H60Y),主要的同义突变为A321T、G404A、A428G和C176T。寻找到理想的B细胞免疫表位10个,最理想的HPV31E6蛋白B细胞预测免疫表位为441PEEKQRHLDKKKRF455和285HGVCTKCLRFYSKVSE301。结论该地区HPV31 E6基因分布呈多态性,该研究数据对HPV的防治和疫苗设计有指导价值。     

devR基因调控的结核分枝杆菌细胞毒性的研究

目的阐明dev R基因表达对分枝杆菌生长及感染能力的影响。方法确认野生型牛分支杆菌卡介苗(M.bovis BCG,简称BCG)、dev R基因敲除的BCG菌株(简称Δdev R)和dev R基因回补的BCG菌株(简称dev R.com)的dev R序列正确;在不同时间点测定600 nm下的吸光度(A)值,绘制3种细菌的生长曲线;以感染复数(MOI)=10感染人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549(简称A549细胞)和小鼠巨噬细胞Raw264.7(简称Raw264.7细胞),分别采用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验于0、24、48、72 h测定细胞凋亡率和乳酸脱氢酶(LDH)释放水平;采用实时定量PCR(RT-PCR)测定凋亡相关基因bcl-2和bad的表达水平。结果Δdev R菌株在早期(培养2~10 d)生长较BCG菌株和dev R.com菌株明显加快(P0.01)。Δdev R菌株感染A549细胞和Raw264.7细胞后,细胞的凋亡和坏死效应明显增加,与BCG菌株和dev R.com菌株比较差异有统计学意义(P0.05)。3种菌株感染A549细胞均导致凋亡相关基因bcl-2表达上调,且Δdev R菌株感染组bcl-2基因表达明显高于BCG和dev R.com菌株感染组;3种菌株感染Raw264.7细胞均导致凋亡相关基因bad表达上调,且Δdev R菌株感染组bad基因表达明显高于BCG和dev R.com菌株感染组。结论 dev R基因敲除的BCG菌株毒力明显增强。     

GⅡ型诺如病毒衣壳蛋白抗原表位预测及单克隆抗体的制备

目的原核表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,制备抗诺如病毒衣壳蛋白VP1的单克隆抗体,并研究其抗原表位特性。方法 PCR扩增GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白基因,将目的基因克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌原核表达。纯化表达产物免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。用Modeller9.9为诺如病毒GⅡ型湖州株VP1蛋白构建三维模型,构建好的三维模型提交到SEPPA在线B-cell空间表位预测软件,对GⅡ型湖州株VP1蛋白进行空间表位预测。用预测的表位序列来筛选阳性克隆,得到对应这些表位的单克隆抗体。结果成功构建重组表达载体pET28a(+)-Noro-VP1并在大肠埃希菌中获得表达,重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用预测的抗原表位多肽筛选,获得10株杂交瘤细胞株。与重组蛋白的ELISA结果显示1E8、1P10、2C15和2L16四株反应性最强,其他几株反应性较弱。Western blotting结果显示只有2K10、1K16、1E8三株能与重组蛋白很好的结合。结论成功制备了抗GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白的单克隆抗体,抗原表位位于衣壳蛋白的P2区,为制备诺如病毒快速免疫诊断试剂盒及抗原表位的研究提供基础。     

HCV NS3诱导小鼠特异性T细胞反应的抗原多肽序列筛选

目的 筛选HCV NS3的小鼠T细胞表位多肽序列.方法 BALB/c小鼠用HCV NS3加po-ly （I∶C）或CpG ODN及Montanide ISA720佐剂免疫后,分离其脾淋巴细胞,以覆盖HCV NS3全基因的合成重叠多肽组成的不同多肽库进行刺激,以ELISPOT及流式细胞术检测分泌干扰素γ（IFN-γ）的细胞数及CD8＋/IFN-γ＋细胞或CD4 ＋/IFN-γ＋细胞百分比,确定抗原性最强的多肽库,找出HCV NS3的小鼠T细胞表位多肽.结果 通过ELISPOT及流式细胞术检测,能够刺激淋巴细胞分泌IFN-γ最多及CD8 ＋/IFN-γ＋细胞或CD4＋/IFN-γ＋细胞百分比最高的多肽被选出作为阳性多肽,其中的一个多肽经进一步的ELISPOT及流式细胞术检测确认,其序列为GGCSGGAYDⅢCDECHS.结论 HCV NS3小鼠T细胞表位序列的确定为HCV疫苗的研究打下了基础.     

Impact of Fgd1 and ddn diversity in Mycobacterium tuberculosis complex on in vitro susceptibility to PA-824

PA-824 is a promising drug candidate for the treatment of tuberculosis (TB). It is in phase II clinical trials as part of the first newly designed regimen containing multiple novel antituberculosis drugs (PA-824 in combination with moxifloxacin and pyrazinamide). However, given that the genes involved in resistance against PA-824 are not fully conserved in the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), this regimen might not be equally effective against different MTBC genotypes. To investigate this question, we sequenced two PA-824 resistance genes (fgd1 [Rv0407] and ddn [Rv3547]) in 65 MTBC strains representing major phylogenetic lineages. The MICs of representative strains were determined using the modified proportion method in the Bactec MGIT 960 system. Our analysis revealed single-nucleotide polymorphisms in both genes that were specific either for several genotypes or for individual strains, yet none of these mutations significantly affected the PA-824 MICs (≤ 0.25 μg/ml). These results were supported by in silico modeling of the mutations identified in Fgd1. In contrast, "Mycobacterium canettii" strains displayed a higher MIC of 8 μg/ml. In conclusion, we found a large genetic diversity in PA-824 resistance genes that did not lead to elevated PA-824 MICs. In contrast, M. canettii strains had MICs that were above the plasma concentrations of PA-824 documented so far in clinical trials. As M. canettii is also intrinsically resistant against pyrazinamide, new regimens containing PA-824 and pyrazinamide might not be effective in treating M. canettii infections. This finding has implications for the design of multiple ongoing clinical trials.     

2型糖尿病患者载脂蛋白CⅢ基因多态性与高三酰甘油血症关系研究

目的探讨中国南通地区汉族2型糖尿病（T2DM）患者中高三酰甘油血症（HTG）是否与载脂蛋白CⅢ（apoCⅢ）基因启动子区T-455C和C-482T多态性有关。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测212例T2DM患者apoCⅢ-455和-482位点多态性的基因型和等位基因频率,同时检测相关生化指标。结果 apoCⅢT-455C和C-482T多态性位点之间存在强连锁不平衡（D＇〉0.7,r2〉0.6,P〈0.0001）。等位基因以常见等位基因-455T和-482C为主,-455和-482位点基因型均分别以杂合型-455TC和-482CT为主。此2个多态性位点等位基因和基因型频率在正常三酰甘油（NTG）组和HTG组之间差异均无统计学意义（P〉0.05）。-455CC和-455TC型患HTG的风险与野生型-455TT相比差异无统计学意义（P〉0.05）,比值比（OR）[95%可信区间（CI）]分别为0.79（0.31～1.99）和1.09（0.52～2.28）。-482TT和-482CT型患HTG的风险与-482CC相比差异也无统计学意义（P〉0.05）,OR（95%CI）分别为1.33（0.53～3.34）和1.65（0.78～3.51）。所有相关生化指标在这2个多态性位点各基因型之间差异也均无统计学意义（P〉0.05）。结论在中国南通地区汉族T2DM患者中,未发现apoCⅢ基因启动子区多态性与HTG有关联,与非T2DM人群中研究结果不一致。     

预防性MPT64和ESAT6疫苗保护力的评价

目的利用BACTEC-960仪分析动物试验模型主要脏器的结核分枝杆菌生长情况,分析结核分枝杆菌MPT64和ESAT6 DNA疫苗预防结核病的效力。方法将BALB/C小鼠随机分成五组,分别用A组生理盐水、B组载体质粒、C组卡介苗、D组重组质粒JW4303-MPT64DNA、E组JW4303-ESAT6DNA免疫9周后,用H37RV结核分枝杆菌强毒株攻击小鼠。分别在攻击一个月后和二个月后观察结果。结果 C、D、E组比B组生长天数总体向后推迟,生长时间明显集中,生长曲峰强度比B组明显减弱,C组肝脏中的感染率比D、E组有所下降。D组肺脏中感染率下降明显。D、E组鼠脾淋巴细胞转化率较C组高,B组明显降低。结论与B组比,小鼠免疫力的短期预防是有所增强,其中卡介苗前期效果明显;MPT64、ESAT6是持续效果好。     

Identification of naturally processed T cell epitopes from glutamic acid decarboxylase presented in the context of HLA-DR alleles by T lymphocytes of recent onset IDDM patients.

Glutamic acid decarboxylase (GAD) has been defined as a major target antigen in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). To identify the molecular ligands triggering a T cell response to GAD, a panel of human GAD65-specific T lymphocyte lines was generated from peripheral blood of three recent onset IDDM patients. All lines derived from a patient expressing the high-risk-conferring HLA-DR*0301/ *0401 haplotypes recognized a single epitope localized between amino acid positions 270 and 283 of GAD65, a stretch that is located in close proximity to the homology region shared with Coxsackie virus P2-C protein. All lines with this specificity were restricted to the DRA, B1*0401 product of the DR4 haplotype. Analysis of the GAD-specific T cell response in a second patient homozygous for DR4 haplotypes demonstrated that the same DRA, B1*0401 allele selected T cells specific for a different determinant. The T cell response profile in a third patient showed that DR*1501/ *1601-encoding haplotypes could present at least three different epitopes to GAD65-specific T lymphocytes. One of these epitopes was presented by a DR allele associated with the resistance-conferring DRB1*1501 haplotype. GAD-specific T cell lines could not be isolated from HLA class II-matched normal individuals. Our data reveal that (a) the T cell response to GAD65 is quite heterogenous in recent onset IDDM patients; (b) HLA-DR, not DQ, seems to be the principal restriction element used by T cells present at the onset of the disease; and (c) T cells responding to epitopes containing identical sequences to Coxsackie virus P2-C protein were not detected.