广州地区儿童空肠弯曲菌感染的检测与分析

目的掌握广州地区空肠弯曲菌引起儿童感染性腹泻的现状,探索空肠弯曲菌的检测方法及耐药状况。方法对2011~2014年该院可疑空肠弯曲菌感染患儿的粪便进行病原菌的分离培养和常规生化鉴定,然后进行聚合酶链反应(PCR)测序确认,同时对所分离菌株进行药敏试验。结果近4年来从2 088例腹泻患儿粪便标本中共检出154株空肠弯曲菌,经生化反应鉴定和PCR检测确认,PCR检测限可达6CFU/mL;该地区儿童感染空肠弯曲菌对亚胺培南和氨基糖苷类药物敏感,对氯霉素、林可霉素和红霉素等抗菌药物耐药率10%,对氟喹诺酮、氨苄西林和四环素有较高耐药率(24.03%~44.16%),对复方磺胺甲噁唑和头孢菌素耐药。结论空肠弯曲菌是儿童腹泻的重要病原菌之一,重症患者可导致严重后果,应引起重视,积极开展对疑似患者的空肠弯曲菌检测;常规检测和特异性的PCR检测有利于提高检出率。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

2016-2018年湖南省株洲市弯曲菌的流行特征及耐药性分析

目的了解湖南省株洲市弯曲菌的流行病学现状和耐药特征。方法2016年7月至2018年6月,在株洲市对腹泻病例和无腹泻症状儿童开展流行病学调查,并采集粪便标本进行弯曲菌的分离培养和耐药性分析。结果共调查人群粪便标本450份,弯曲菌的检出率为6.44%(29/450),其中无腹泻症状儿童的检出率为1.00%(1/100),腹泻病例的检出率为8.00%(28/350)。弯曲菌感染的临床症状以腹泻、腹痛、黏液便、粪便镜检均有红、白细胞为主;5~岁组检出率较高,为19.44%(7/36);学生的检出率最高,为17.65%(6/34);男、女性患者的检出率差异无统计学意义(χ2=1.354,P=0.245);春秋季弯曲菌的检出率高于夏冬季。29株弯曲菌中24株为空肠弯曲菌,5株为结肠弯曲菌,其中41.38%的菌株为多重耐药菌株,菌株对萘啶酸、环丙沙星和四环素的耐药性较强,分别为96.15%、88.46%、76.92%。结论空肠弯曲菌、结肠弯曲菌感染已成为株洲市感染性腹泻的重要病原菌之一,耐药性严重并存在多重耐药现象,应加强弯曲菌的监测和防控。     

2017年北京市顺义区腹泻患者弯曲菌流行特征及耐药性分析

目的 了解北京市顺义区弯曲菌引起腹泻的现状,探索弯曲菌分离检测方法及其耐药特征。 方法 收集2017年顺义区2家医院成年人腹泻患者的粪便标本进行沙门菌、志贺菌、致泻大肠埃希菌和副溶血弧菌的分离培养。 用滤膜法分离培养弯曲菌并进行药敏试验。 结果 372份粪便标本共检出39株弯曲菌,检出阳性率为10.48%,包括36株空肠弯曲菌（92.31%,36/39）和3株结肠弯曲菌（7.69%,3/39）。 沙门菌、志贺菌、致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌的阳性率分别为6.99%（26/372）、0.27%（1/372）、9.14%（34/372）、12.63%（47/372）。 弯曲菌感染病例的临床症状以腹泻、腹痛、恶心、脱水为主,且多为水样便。春秋季检出率高于夏冬季,高峰出现在10月。弯曲菌感染病例以16 ~ 45岁青壮年居多;男、女性检出率差异无统计学意义（χ2＝0.150,P＝0.698）;职业以学生、其他职业、商业服务居多。 可疑感染食品为蔬菜类、粮食类、水产及其制品。 3株结肠弯曲菌分离株仅对氯霉素敏感。 36株空肠弯曲菌分离株对喹诺酮类、四环素类和氯霉素类抗生素的耐药率最高,包含萘啶酸（97.22%）、环丙沙星（97.22%）、四环素（86.11%）、氟苯尼考（58.33%）。19株空肠弯曲菌（52.78%）存在多重耐药,多重耐药谱主要为喹诺酮类–氯霉素类–四环素类（47.37%,9/19）。 结论 弯曲菌感染引起腹泻的比例较高,春秋季高发,耐药性严重且存在多重耐药现象,应引起重视。      

深圳市南山区腹泻患者弯曲菌感染及病原学特征分析

目的获得本地区秋季腹泻患者弯曲菌的感染现状及病原学特征。方法收集深圳市南山区2018年9 — 11月腹泻患者的粪便标本,采用双孔滤膜法分离培养弯曲菌并应用荧光聚合酶链式反应（PCR）方法进行菌种鉴定。 应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）对分离菌株进行分子分型,应用琼脂稀释法获得菌株对11种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。 根据菌株的序列分型（ST）结果,结合既往菌株分型数据进行本地区菌株的遗传聚类分析。结果共采集腹泻患者粪便标本150份,其中男性患者74例,女性患者76例,年龄在1～86岁之间。 150份粪便标本中共分离到弯曲菌18株,检出率为12.00%（18/150）。 菌种鉴定发现,空肠弯曲菌占77.78%（14/18）,结肠弯曲菌占22.22%（4/18）。 14株空肠弯曲菌可分为11种PFGE带型,8个ST型别,以ST9763最多（35.71%,5/14）,是本研究新发现ST型别。 14株空肠弯曲菌对四环素全部耐药,对红霉素、阿奇霉素、泰利霉素、庆大霉素、链霉素及克林霉素100.00%敏感。 ST型别最小生成树聚类分析结果表明,不同宿主来源菌株没有显著聚集性,腹泻患者分离菌株分布在不同来源的组群中。结论采用双孔滤膜法提高了腹泻患者中弯曲菌的检出率。本地区弯曲菌的感染仍以空肠弯曲菌为主, 分离菌株对四环素类、喹诺酮类抗生素呈现较高的耐药特征,分离的空肠弯曲菌ST呈弥散分布特点。     

2014－2018年江苏省无锡市感染性腹泻病原监测结果分析

目的了解江苏省无锡市感染性腹泻的病原谱及流行特征。方法于2014 — 2018年采集无锡市哨点医院门诊感染性腹泻病例粪便标本,采用分离培养法检测沙门菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌和副溶血弧菌,采用real-time PCR法进行诺如病毒、轮状病毒、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的核酸检测。结果3?408 例腹泻病例中,共检出阳性样本946份（混合感染66份）,总检测阳性率为27.76%。 其中细菌感染529份,阳性率为15.52%,病毒感染460份,阳性率为13.50%,混合感染66份。 细菌性病原体中,致泻性大肠埃希菌分离率最高（6.60%）,其次为沙门菌（5.11%）、副溶血弧菌（4.05%）、志贺菌（0.32%）,主要流行于夏季。 病毒性病原体中,诺如病毒（8.92%）和轮状病毒（3.29%）检测阳性率较高,主要流行于冬春季。 不同年龄组人群病原体阳性率不同,轮状病毒感染高发于0 ~ 4岁年龄组。结论2014 — 2018年无锡市感染性腹泻的主要病原体是致泻性大肠埃希菌、沙门菌、副溶血弧菌、诺如病毒和轮状病毒,夏季以细菌性腹泻为主,冬春季以病毒性腹泻为主,在不同季节应针对5岁以下婴幼儿和老年人等重点人群采取不同防控措施。     

腹泻样本中创伤弧菌的检测分析

目的 了解浙江省部分地区腹泻患者创伤弧菌的感染情况。 方法 对2010年6-10月采集的标本,经3%氯化钠碱性蛋白胨水于37 ℃增菌后,划线纤维二糖多粘菌素E平板于40 ℃培养18~24 h,挑取可疑菌落进行分子生物学鉴定。 结果 在144份腹泻患者粪便样本中检测分离到2株创伤弧菌,阳性率为1.39%(2/144);均为生物Ⅰ型,其基因型为vcgC/16S rRNA B型。药敏结果显示分离的创伤弧菌对氨基糖苷类抗生素耐药如阿米卡星、庆大霉素。 结论 在监测的腹泻样本中分离到具有较强致病能力的创伤弧菌,且氨基糖苷类抗生素耐药,应加强对海水产品和腹泻样本中创伤弧菌的检测及耐药分析,预防创伤弧菌的感染暴发。     

腹泻病病原学研究临床价值

目的:探讨引起腹泻的病原微生物种类和构成特点及其流行情况.方法:采集腹泻患者粪便,进行致泻性大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌和弧菌培养鉴定和血清定型检测;对其中水样便且病原菌检测阴性的标本进行轮状病毒、诺沃克病毒、肠道腺病毒和星状病毒荧光PCR检测.结果:在2 627份粪便标本中,共检出肠道病原菌257株,其中致泻性大肠埃希菌142株(55.3%),副溶血弧菌97株(37.7%),沙门菌17株(6.6%),志贺菌1株(0.4%);未检出霍乱弧菌和空场弯曲菌;5份标本同时检出2种病原菌.在668份病原菌检测阴性的水样便标本中,有274份检出肠道病毒,其中诺沃克病毒180份(65.7%),轮状病毒77份(28.1%),星状病毒15份(5.5%)和肠道腺病毒2份(0.7%);4份同时检出轮状病毒和诺沃克病毒.结论:腹泻病原微生物类型复杂多样,以致泻性大肠埃希菌和诺沃克病毒感染居多,加强腹泻病原微生物的常规检验对腹泻病的病因诊断和治疗有重要临床价值.     

模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。     

粪便样本中志贺菌分离培养方法的优化

目的 优化从腹泻患者粪便标本中分离培养志贺菌的方法.方法 使用EC肉汤和志贺菌增菌液对129份粪便样本进行增菌培养,采用普通PCR方法检测ipaH基因,使用木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂(XLD)培养基、麦康凯琼脂(MAC)以及沙门志贺菌培养基(SS)等选择性培养基分离培养志贺菌.使用志贺菌参考菌株,进行模拟增菌培养,利用荧...     

四种检测方法用于上海市口岸管道水军团菌存在状况调查的研究

目的比较传统的平板培养法、普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,real-time PCR)和荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)结合荧光定量PCR的方法(EMA-荧光定量PCR)对管道水中军团菌的检测效果。方法于2010年对上海市2个口岸管道水进行采样,共采集132份。分别采用传统的平板培养法、普通PCR、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR对水样中军团菌进行定性和/或定量分析。结果对132份管道水标本进行军团菌定性检测,平板培养法、普通PCR、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR检出军团菌污染率分别为18.9%、20.5%、24.2%和24.2%。3种定量方法(平板培养法、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR)对阳性标本中军团菌定量数值分别为50~1320菌落形成单位/升(cfu/L)、20~13 085基因单位/升(GU/L)和10~4480 GU/L。对于132份水样,3种方法对军团菌含量分析的定量数值大小差异有统计学意义(χ2=193.6,P0.01),其中荧光定量PCR的定量数值最高,EMA-荧光定量PCR的数值次之,平板培养的数值最低。结论上海市口岸管道水中军团菌污染率和含菌量高。荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR方法检测管道水中军团菌的灵敏度优于传统的培养方法,EMA-荧光定量PCR方法适合用于环境水体中军团菌活菌监测。     

通过增加痰液量和超声裂菌提高结核分枝杆菌荧光定量PCR检出率

目的通过增加痰液量和超声破碎法提取痰液中的结核菌DNA,提高结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的检出率。方法选择206例肺结核患者,以103例非结核患者作为对照组;肺结核患者同时进行结核菌涂片,并在美国BD公司的MAGIT960仪器上进行液体快速培养结核菌。另收集至少5 mL的痰液,加入2~3倍体积的4%氢氧化钠液化后,取1 mL按照采用常规方法抽提痰液中的结核菌DNA,剩余部分采用改进的超声破碎法提取结核菌DNA;两者同时进行实时荧光定量PCR检测。结果采用增量超声法,对于涂片阳性、培养阳性的结核患者,阳性检出率由87.5%(可信区间为81.4%~93.6%)提升至95.5%(可信区间为91.7%~99.4%)(P0.05)。对于涂片阴性、培养阳性的患者,阳性检出率由57.4%(可信区间为47.5%~67.4%)提高至83%(可信区间为75.4%~90.6%)(P0.01)。增量超声法比常规方法,定量值平均提高14倍以上。结论通过增加痰液量和超声破碎法提取痰液中的结核菌DNA,可提高实时荧光定量PCR结核分枝杆菌的检出率,值得进一步推广应用。     

空肠弯曲菌 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量 PCR快速检测

目的　开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检 测。方法　针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A 和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB 双重探针 实时荧光定量PCR 检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价, 应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果　建立的 空肠弯曲菌TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交 叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA 线性范围达10 个数量级,最低检测限为 4 个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78 例临床标本中定 量检出28 例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR 和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6 株存活的空肠弯曲菌。 结论　TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠 弯曲菌定量检测,值得推广应用。     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。     

2013年北京地区5岁以下儿童病毒性腹泻病原学研究

目的了解北京地区5岁以下儿童病毒性腹泻的流行病学特征,为病毒性腹泻的防治提供理论依据。方法全年随机采集北京市2家三级甲等医院的5岁以下腹泻患儿粪便标本,利用酶联免疫吸附试验检测轮状病毒(HRV)、用聚合酶链反应(PCR)检测杯状病毒(HuCV)、肠道腺病毒(AdV)及星状病毒(AstV)。结果研究期间共收集病毒性腹泻患儿粪便标本243份,标本总阳性检出率52.7%(128/243),4种病毒阳性检出率分别为HRV(26.3%,64/243)、HuCV(16.9%,41/243)、AdV(4.9%,12/243)和AstV(4.5%,11/243),分别占总阳性检出的49.9%、32.1%、9.3%和8.5%(其中包括混合感染10例,占总阳性检出的7.8%)。患者以≤2岁儿童为主,不同年龄组之间病毒总检出率差异有统计学意义(χ2=13.397,P=0.009),不同病毒发病高峰期不同,男女罹患率差异无统计学意义(χ2=0.220,P0.05)。结论 HRV和HuCV是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体;4种病毒总检出率以12~18月龄组最高;全年中以12月的病毒检出率最高;存在一定比例的混合感染。     

实时荧光 PCR 技术和细菌培养法检测妊娠晚期孕妇定植B 群链球菌临床分析

目的：探讨应用实时荧光 PCR 技术和细菌培养法检测妊娠晚期孕妇定植 B 群链球菌（GBS）的敏感性。方法采集孕妇生殖道-直肠分泌物拭子2份,一份标本用普通细菌培养法、另一份用实时荧光 PCR 技术检测生殖道 GBS。比较两种方法的准确性、快速性。308例孕妇根据实时荧光 PCR 检测分为 GBS 阳性组与 GBS 阴性组,通过对比较分析 GBS 与发生胎膜早破的关系。结果将308例孕妇进行生殖道 GBS 检测,用普通细菌培养法进行培养有18例阳性,阳性率5．8％（18/308）,实时荧光 PCR检测有29例阳性,阳性率9．4％（29/308）。在 PCR 检测 GBS 阳性组中,发生胎膜早破9例,发生率为31％。在 PCR 检测 GBS阴性组中,发生胎膜早破33例,发生率为11．83％。结论该次调查结果显示实时荧光 PCR 技术的阳性检出率明显高于细菌培养法,应用该法检测技术为 GBS 的快速诊断以及更加准确有效地进行抗菌药物预防提供了依据。     

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应（PCR）与第2代杂交捕获法（HC-Ⅱ）2种人乳头瘤病毒（HPV）检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV，对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好，总符合率为77％，总一致性指数（Kappa指数）为0．538。其中，高度鳞状上皮细胞内病变（HSIL）组二者的符合率为82％，Kappa指数为0．410，一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好，尤其对于HSIL患者，可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。     

血清 GSTP1基因甲基化定量分析在肝细胞癌的早期诊断价值

目的：建立实时荧光定量甲基化方法研究肝细胞癌（HCC）患者外周血血清中游离谷胱甘肽-硫-转移酶P1基因（GSTP1）启动子区域甲基化状态,探讨其是否可作为HCC早期诊断的指标。方法收集95例血清标本,包括40例HCC、30例肝硬化和25例健康体检者,采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）技术对血清中GSTP1基因的甲基化水平进行定量分析,应用接受者操作特性（ROC）曲线评估其诊断价值。结果肝癌患者血清中GSTP1基因甲基化定量水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义（P＜0．05）。ROC曲线分析表明通过GSTP1基因甲基化定量分析能够高效区分肝癌和肝硬化及健康者（AUC＝0．8641）,以甲基化率2％作为诊断HCC的临界值,其诊断特异度为87．5％,敏感度达69．6％;联合检测血清GSTP1基因甲基化和血清AFP可将HCC检出率提高至75％。结论实时荧光定量甲基化方法可精确定量血清中GSTP1基因甲基化水平,在HCC的早期诊断中有一定的应用价值。     

Real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Campylobacter jejuni on chicken rinses from poultry processing plant

Campylobacter jejuni (C. jejuni) is the leading cause of food-borne gastroenteritis in the United States. Detection of Campylobacter in food samples by conventional culture is cumbersome; therefore, there is a need to develop rapid and cost-effective detection and quantification methods. Eighty-four whole chicken rinses were collected at different stages of processing at three poultry processing plants. After chicken wash collection and DNA extraction, the samples were directly subjected to real-time PCR (rtPCR) without enrichment and also culture. The assay specificity was determined with a range of Campylobacter species, related, and unrelated organisms. Of the 84 samples collected 65 (77%) of the samples were positive by the rtPCR assay and 27 (32%) of the samples tested positive by direct plating to selective agar media. The results were positively concordant for 27 (32%) of the samples. The whole rtPCR assay can be completed within 90min with a detection limit of 1CFU, compared to 5-7 days for enrichment and sub culturing in selective agar. This assay is the first report of rtPCR method capable of detecting and quantifying C. jejuni from chicken rinses without an enrichment step and could be an important, rapid and quantification model for other food-borne pathogens.