猪软骨细胞外分泌基质功能检测的实验研究

寻找体外传代培养猪耳廊软骨细胞最适宜接种的种子细胞。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种６＊１０＾６个细胞于培养皿,每周传代１次,连续５周,留取所有培养液,用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。     

猪关节软骨细胞体外培养及其形成糖胺多糖能力的实验研究

目的:观察软骨细胞体外培养的情况及其合成糖胺多糖的特点。方法:通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106个细胞于培养皿,加入培养基,每周传代一次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法(AlcianBlue)测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)的变化;利用倒置显微镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果:软骨细胞在pH值为7.0,含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长良好,体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质,第二代传代细胞分泌GAG的能力最强。结论:软骨细胞体外培养生长良好,合成大量的糖胺多糖类基质。传代第二代是最佳接种时间。     

猪耳廓软骨细胞体外培养

目的 为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法 用消化组织块培养法体外培养猪耳廓软骨细胞。结果 软骨细胞在ＰＨ值为７．２０,含１０％胎牛血清的Ｆ１２培养基中生长良好,可传代４～５代,细胞数目扩增为原来的１０～２０倍。结论 消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以扩增软骨细胞数目的确实可行的方法。     

转化生长因子-β_1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的 :观察转化生长因子 β1 (TGF β1 )对软骨细胞外分泌基质糖胺多糖 (GAG)含量的影响。方法 :通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞 ,定量接种 6× 10 6 个细胞于培养皿 ,在细胞贴壁后更换培养基时 ,加入TGF β1 10ng mL ,每周传代 1次 ,连续 5周 ,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质GAG的变化 ;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果 :体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质 ,第 2代传代细胞分泌GAG的能力最强 ;加入TGF β1 能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。结论 :TGF β1 能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质     

取向性关节软骨细胞外基质源性支架对负载软骨细胞生物学行为的影响

目的：观察取向性关节软骨细胞外基质源性支架对负载软骨细胞的黏附、增殖、分布及排列的影响。方法：利用定向结晶及冷冻干燥技术制备猪关节软骨细胞外基质源性取向支架。分离、培养犬关节软骨细胞,接种在支架上体外培养,CCK-8试剂盒检测细胞在支架上的黏附和增殖,倒置显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及H＆E染色观察软骨细胞在支架上的形态、分布和排列情况,并以接种在非取向支架上的软骨细胞的生物学特性作为对照。结果：软骨细胞在两种支架上均能较好的黏附生长,大部分细胞呈圆球形;但在取向支架上增殖比在非取向支架上快（P〈0.05）;并且在取向性支架上软骨细胞能沿着支架孔道的取向性生长,在支架内部分布均匀,类似天然软骨组织的柱状结构;而在非取向性支架内软骨细胞呈无序排列,分布不均匀,支架内部细胞数量较少。结论：取向性软骨细胞外基质源性支架利于软骨细胞黏附、增殖,能引导软骨细胞分布排列呈类似于天然软骨细胞的柱状排列方式,是一种较理想的软骨组织工程支架。     

细胞高密度培养促进兔关节软骨细胞糖胺多糖合成作用研究

目的 研究细胞密度对体外培养兔关节软骨细胞糖胺多糖(glycosaminoglyean,GAG)合成的影响.方法 1月龄新西兰兔5只,无菌手术切取双膝关节软骨,采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分:一部分以密度2×104/cm2接种,传代时仍以相同密度接种;另一部分在细胞贴壁后人工降低细胞密度至2×103/cm2培养.原代(P0)和传1代(P1)细胞均在细胞融合后换液,并且于换液后12,24,36,48,60 h分别抽取上清测量GAG浓度.采用重复测最资料的方差分析,比较低密度培养P0组与高密度培养P0组、P1组上清GAG浓度.结果 低密度培养P0组上清GAG含量显著低于高密度培养P0组(P<0.001),且低于体外培养时间略长的高密度培养P1组软骨细胞(P<0.05).结论 高密度培养更有利于软骨细胞维持表型,是软骨平面培养的较好方式.     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养构建软骨的体内评价

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞（BMSC）共培养体外构建复合物体内植入形成成熟软骨组织的可行性。方法体外培养扩增猪BMSC,经绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染标记后,与猪关节软骨细胞按1：1比例混合,以5．0×10^7／ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）材料支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种PGA／PLA作为阳性对照组及阴性对照组。各组标本均于体外培养2周后植于裸鼠皮下,8周后取材,通过大体观察、激光共聚焦显微镜观察、糖胺聚糖含量测定、生物力学、组织学以及免疫组织化学等方法对新生软骨组织进行全面评价。结果各组细胞均与材料黏附良好。体内植入8周后,共培养组及阳性对照组标本基本保持植入前的大小和形状,外观类似软骨组织,组织学显示两组均有连续的软骨陷窝样结构形成,免疫组织化学显示有大量Ⅱ型胶原沉积。定量测定结果显示,共培养组的糖胺聚糖含量和弹性模量均达到软骨细胞构建软骨组织的80％以上。共聚焦显微镜观察可见EGFP标记细胞形成了软骨陷窝。阴性对照组标本的体积较植入前明显缩小,组织学及免疫组织化学均未见软骨样组织形成。结论软骨细胞与BMSC共培养构建的复合物植入体内后能继续形成成熟软骨组织,这表明植入体内后软骨细胞仍能保持对BMSC的诱导作用。     

体外培养软骨细胞方法及其影响因素的研究进展

体外软骨细胞的培养是了解软骨细胞生物学性状的重要方法.了解软骨细胞分化、增殖及软骨基质合成等诸多影响因素,有助于研究骨性关节炎发病机制,促进软骨组织工程的发展.随着近年来相关研究的飞速发展,人们发现软骨细胞可用多种方法进行体外培养,并受到众多因素的调控.本文对其调控因素的研究进展综述如下.     

氟浓度对体外培养大鼠软骨细胞糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖（GAG）和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组（6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml）,孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异（P＞0.05）;阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升（P＜0.05）.结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.     

动态力学刺激对三维培养软骨细胞作用的初步研究

目的探讨在三维多孔支架环境里动态循环压力刺激对软骨细胞的作用。方法原代培养兔软骨细胞,传代扩增后接种于1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm聚乳酸多孔（polylactic acid,PLA）支架,培养5 d后,施加0.5、1、2 N的正弦动态循环压力,频率0.017 Hz,加压8 h,以无压力组（0 N）作为对照。标本做扫描电镜及组织学切片染色,观察细胞数量、形态及排列的变化。结果在三维PLA多孔支架上,扫描电镜观察到,动态压力组细胞的增殖比无压力组更多,排列也更加有序;动态压力为2 N的时候,细胞增殖、形态比1、0.5 N及无压力组更好,贴附细胞计数与1、0.5 N及无压力组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。结论动态循环压力对于三维培养条件下的软骨细胞有促进增殖和有序排列的作用,但何种强度的压力更适合体外构建组织工程软骨尚需进一步研究。     

兔软骨细胞的分离与培养

目的 探讨免软骨细胞培养方法。方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4～5天，细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖，异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显。结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。     

兔关节软骨细胞的体外培养及凋亡相关基因在传代细胞中的表达

目的验证体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔软骨细胞的可行性,探讨凋亡及抗凋亡基因在软骨细胞传代中的变化,寻找关节软骨退变老化研究的最适宜靶细胞。方法在无菌条件下取6周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;形态学观察时采用甲苯胺蓝染色法对关节软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测P0~P4代软骨细胞烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、信息沉默因子1（Sirt1）、p53、Bax基因的mRNA相对表达量,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各代关节软骨细胞增殖情况。结果显微镜下观察兔原代软骨细胞大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形特征,72h全部贴壁生长。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;连续培养至P4代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。随着软骨细胞的传代,NAMPT的表达量逐渐下调。与P0代软骨细胞相比,Sirt1的表达量在P1代细胞中明显上调,在P2代细胞急剧下降至P0代以下,在P3~P4代细胞中Sirt1的表达量逐渐下调。凋亡基因p53和Bax的表达量随着软骨细胞的传代而上调。前3代软骨细胞增殖差异无统计学意义（均P＞0.05）;在培养到第4~7天时,P1~P3代与P4代软骨细胞增殖差异有统计学意义（P＜0.05）。结论采用体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞是切实可行的。随着软骨细胞的传代,抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表达逐渐下调,凋亡基因p53、Bax的表达逐渐上调。P1~P3代关节软骨细胞作为研究关节软骨凋亡的细胞体系是合适的。     

组织工程修复关节软骨缺损的实验研究

目的　用组织工程的方法 ,将新生关节软骨细胞先在高分子聚乳酸材料上进行体外培养 ,然后移植于关节软骨缺损处 ,以达到修复关节软骨缺损的目的。方法　取新生新西兰兔关节软骨细胞培养于高分子聚乳酸材料支架上。将 16只兔的 32个膝关节股骨髁处人工造成一 4m m× 6 m m大小缺损 ,并随机分为二组。 组 10只兔 ,2 0个关节缺损 ,用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植修复。 组 6只兔 ,左膝用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植体修复 ,表面覆盖单层软骨细胞 ;右膝仅用高分子聚乳酸材料修复。术后分别于 4、8、12、2 4周取标本进行大体、光镜、组织化学的方法进行结果评估。结果　用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植体能修复关节软骨缺损 ,且为透明软骨。新生软骨组织胶原定型为 型胶原。结论　用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植体移植 ,关节软骨缺损能获得透明软骨修复     

姜黄素对骨关节炎软骨细胞增殖及分泌MMP-13、IL-6的影响

目的 探讨姜黄素对骨关节炎(OA)软骨细胞增殖及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、白细胞介素-6(IL-6)分泌的影响。方法 选取2018年1～6月在我院骨科接受关节置换的10例骨关节炎患者的关节软骨,设为炎症软骨细胞组(OA组),按是否加入姜黄素分为单纯培养基组(OAa组)与加入姜黄素组(OAb组);另选取因外伤致截肢的4例患者膝关节软骨为对照,设为正常软骨细胞组(N组),按是否加入姜黄素分为单纯培养基组(Na组)与加入姜黄素组(Nb组)。进行软骨细胞培养,配制姜黄素溶液,加入姜黄素溶液(80μmol/L)刺激软骨细胞,采用MTT法检测软骨细胞增殖,测定上清液MMP-13、IL-6水平。结果 OAb组吸光度值明显低于OAa组(P0.05),Nb组吸光度值较Na组下降,但差异无统计学意义(P0.05)。OAb组上清液MMP-13、IL-6水平均低于OAa组(P0.05),OA组MMP-13、IL-6水平均高于N组(P0.05)。结论 姜黄素对OA软骨细胞增殖及释放MMP-13、IL-6均有明显抑制作用,可保护关节软骨细胞,减轻炎症反应。     

黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的:研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖(GAG)合成的影响。方法:分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ(GlcAT-1)mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果:各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成(P<0.01);1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论:黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

不同年龄兔关节软骨细胞的力学特性

细胞都表现出典型的黏弹性固体蠕变特征;老年关节软骨细胞的黏弹性特性较幼年和成年软骨细胞明显下降.