人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的:构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法:提取健康成年牛的白细胞总RNA,经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段,并将其克隆到载体pGEM-T Easy,经限制性内切酶EcoR I和 Not I双酶切鉴定及序列测定后,再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET-2R,转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白.结果:获得682 bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段.以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为30 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中,Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合.结论:成功地构建了原核表达载体pET-2R,并表达出重组蛋白.为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础.     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

野生型及突变型人白细胞介素13的原核表达及活性分析

目的:在大肠杆菌中表达野生型和突变型重组人IL13,经纯化复性获得具有有活性的蛋白。方法:用PCR扩增IL13基因片段,用定点突变PCR获得其突变体(IL13’)基因。将IL13和IL13’基因分别克隆至原核表达载体pET30a( )中,构建重组体pET30a( )IL13和pET30a( )IL13’,分别命名为pETIL13和pETIL13’。以重组体转化E.coliBL21(DE3)在IPTG诱导下进行表达。表达产物用NiNTA层析柱进行纯化。纯化产物用氧化还原谷胱甘肽系统透析复性后,检测其生物学活性。结果:在E.coliBL21(DE3)中表达了IL13/IL13’His6融合蛋白。经SDSPAGE显示,融合蛋白的Mr约17000,经Westernblot证实为人IL13。表达的融合蛋白以包涵体的形式存在,纯化后得到较高纯度的重组蛋白。复性后的包涵体检测具有生物学活性。结论:成功地获得具有生物学活性的野生型和突变型人IL13重组蛋白,为下一步研究奠定了基础。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

牛IgG2Fc受体（boFcγ2R）胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体，并在E.coli BL21（DE3）中表达。方法：提取健康成年牛的白细胞总RNA，经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段，并将其克隆到载体pGEM-TEasy，经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切鉴定及序列测定后，再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组质粒pET-2R，转化E.coli BL21（DE3）经LPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得682bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21（DE3）后，经IPTG诱导，表达出相对分子质量（Mr）约为30000的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21（DE3）的胞质中，Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论：成功地构建了原核表达载体pET-2R，并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。     

弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析

本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)基因原核表达重组质粒,进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性.设计合成引物,从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析.目的片段用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7,而后转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,Western blotting分析表达蛋白.结果显示,从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710 bp的GRA7基因片段,构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序,目的基因片段与预期相符.重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后,可高效表达重组蛋白,Western blotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别,而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白.原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性,为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础.     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E. coli BL21(DE3)中表达.方法:采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩ-TE高效的原核表达载体中,构建重组质粒pTΩ-TTSE.将pTΩ-T7SE转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后用Western blot鉴定融合蛋白.结果:获得全长为1 284 bp的融合的HBV/HEV的基因片段.已构建的重组质粒pTΩ-T7SE转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为50 000重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中,表达量约占全菌蛋白的30.52%.Western blot结果表明在Mr为50 000处可见特异性着色带.结论:成功构建了原核表达载体pTΩ-T7SE,并表达出目的蛋白,为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础.     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

大肠杆菌表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份

目的 重组表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份。方法 采用DNA重组技术将尿素酶B亚单位3’端732bp基因片段克隆至pET11C载体上，转化宿主菌BL21（DE3）E.coli,IPTG诱导，SDS-PAGE及Western-blot分析表达情况。结果 成功构建了含UreB0.7kb片段的重组质粒pET-UreB0.7，并表达了具有免疫反应性的分子量约28000u的重组蛋白，表达率为19.8%。结论 重组的尿素酶B亚单位跨膜区成份为研究其相关生物学特性奠定了重要基础。亦可作为Hp疫苗的成分用于Hp感染的预防和治疗。     

人FGF12融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：在原核表达系统中获得高效表达的人成纤维生长因子12融合蛋白。方法：采用逆转录PCR方法获得hFGF12 cDNA，将其连接到pET 28a原核表达载体，转化入BL21(DE3)菌中表达，经金属螯合亲和层析法和肝素亲和层析法纯化，以刺激NIH 3T3成纤维细胞增殖实验；测定纯化的hFGFl2融合蛋白活性。结果：表达产物经SDS-PAGE电泳，在Mr31000附近新增一条明显区带，与预期的相对分子质量相符。重组融合蛋白能刺激NIH3T3细胞增殖。结论：在大肠杆菌中表达了具有促有丝分裂活性的融合蛋白。     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

脆性X智力低下蛋白的克隆表达与纯化

目的 探讨脆性X智力低下蛋白(FMRP)的克隆表达与纯化条件.方法 用分子克隆的方法构建重组质粒pET22b( )-FMR1,并将其转入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用固化Ni2 吸收色谱纯化重组FMRP,Western-blot鉴定并将纯化得到的蛋白与已知的RNA片段进行结合反应.结果 成功构建了重组表达质粒pET22b( )-FMR1,在E.coli BL21(DE)中表达出相对分子质量约79 000的蛋白;该蛋白为FMRP,且可与特定RNA相互作用.结论 在原核系统中表达得到了纯度和活性都较为理想的FMRP蛋白,为相关功能性研究奠定了基础.     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.