IDT与IFAT法检测狂犬病毒抗体的比较研究

ＩＤＴ与ＩＦＡＴ法检测狂犬病毒抗体的比较研究陈阳，王惠榕，于恩庶人和动物接种狂犬病疫苗后是否具有免疫力，多用小白鼠中和试验测定。这种试验需要有病毒株和小白鼠，费时费力费钱，在一般基层很难做到。我们建立的酶免疫斑点试验（ＩＤＴ），测定抗体，获得较好的结...     

应用Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究

目的建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法。方法根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值。结果该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性。该方法的检测下限达10-1TCID50/100μl。12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性。结论TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测。     

用定量RT-PCR方法检测脑梗死半影区内凋亡相关基因的表达

目的 建立脑梗死后脑组织凋亡相关基因表达定量检测的精确、可靠的方法.方法 采用SYBR Green荧光定量RT-PCR法,结合免疫组织化学,测定自发性高血压大鼠脑梗死后不同时相点几种凋亡相关基因的表达水平,包括：caspase 3/CPP32、rIAP、caspase 2等,同时比较其与半影区凋亡细胞数的相关性.结果 在脑梗死半影区,凋亡细胞数量自3 h开始逐渐升高,24 h达到高峰,然后保持较高水平.而caspase 3/CPP32自8 h才升高,12 h达到高峰,3 d时便迅速回落到正常水平,而rIAP,在8 h升高一倍,然后迅速降至正常,caspase 2表达水平在脑梗死后与假手术组比较无明显改变.结论 caspase 3/CPP32是影响神经元凋亡的重要因素,但非唯一的和必不可少的,在脑缺血后,caspase 3/CPP32等的激活或许与神经元凋亡的加重有关.     

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用北大核心CSCD

目的建立GI、GII型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用。方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价。结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GI、GII型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56%(10/180),符合率达97.22%,荧光定量RT-PCR检测率为8.33%(15/180),符合率达100%;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒。结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏。     

鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立检测鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的实时荧光定量RT-PCR方法。方法根据LCMV核蛋白编码基因序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应体系和条件,建立LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,然后进行灵敏度、特异性和重复性试验,并对79份宁波口岸捕获的鼠样品进行检测。结果建立实时荧光定量RT-PCR方法对鼠肺总RNA检测的灵敏度为20pg,是常规PCR方法的100倍;试验的重复性良好,CV值为0.85%;试验的特异性为100%。用该方法检测79份鼠样品有3份LCMV阳性,与常规RT-PCR结果一致。结论成功建立了鼠LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,对于监测和防控鼠传LCM有重要意义。     

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要：为了快速高效的检测所有血清型口蹄疫病毒（FMDV）,根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针,通过反应条件的优化,建立了一步法荧光定量RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,该方法能特异性检测A型、O型、Asia I型FMDV,而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性;检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR敏感性高10倍;对4份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。     

基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的在我国狂犬病均由基因1型狂犬病病毒（rabies virus,RV）引起。本研究针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和Taqman探针,在优化反应条件的基础上,建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法。方法与结果该方法能特异检测基因1型,不能检测基因2-7型和犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、水泡性口炎病毒（VSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）等5种非狂犬病病原体,其检测灵敏度可达到4.68个TCID50的病毒含量。用该方法对29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品进行检测,并与国际金标准确诊方法狂犬病荧光抗体染色法（FAT）和乳鼠脑内接种试验（MIT）及本实验室建立的套式RT-PCR方法进行比较。结果表明所建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100%,二者均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品,而FAT只检测出12份阳性的新鲜样品和1份阳性的腐败样品,MIT只检测出12份阳性,未检测出阳性腐败样品。检测中FAT和MIT确诊的所有阳性样品在qRT-PCR检测均是阳性,而在FAT检测为阴性的4份腐败样品在qRT-PCR为阳性,说明所建立的qRT-PCR方法准确性达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。结论研究结果表明该qRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、污染率低、操作简单,在我国动物狂犬病临床诊断上具有巨大的应用价值。     

内参照基因在实时荧光定量RT-PCR检测中的应用

目的 建立测定内参照β-actin表达量的实时荧光定量RT-PCR两步法检测方法.方法 根据Genbank 中人β-actin保守区域序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的特异性和重复性.结果 建立了人β-actin实时荧光RT-PCR检测方法.结论 本实验建立的人β-actin表达实时荧光RT-PCR两步法检测方法特异性和重复性较好,为β-actin作为定量RT-PCR中内参照基因进行人其他功能基因和病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

RFFIT和MNT检测狂犬病毒中和抗体的比较研究

目的 对RFFIT和MNT两种方法检测抗狂犬病毒中和抗体的相关性,敏感性和重复性进行比较.方法 用MNT和RFFIT两种方法来检测已免疫的人血清52份,未免疫的人血清40份.结果 显示这两种方法检测已免疫血清的一致性是88.5%,其相关性是r=0.886,MNT的敏感性和特异性分别是84.9%,100%,RFFIT的灵敏度和特异性分别是100%,89.0%.MNT和RFFIT重复检测一个样品的变异系数(CV)分别是62.3%、13.3%.结论 RFFIT与MNT的相关性较好,RFFIT的灵敏度和重复性均比MNT好,因此,RFFIT在大多数需要检测RV中和抗体的情况下可替代MNT.     

Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测甲3型流感病毒

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RTPCR方法用于检测甲3型流感病毒核酸。方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在甲3型流感病毒血凝素(HA)基因的保守区设计引物和TaqMan探针、并进行筛选。对荧光RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度。并对疑似流感含漱液标本进行检测。结果该方法对甲3型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、乙型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR是一种快速检测甲3型流感病毒特异、敏感的新方法。     

四种单增李斯特菌常用核酸检测方法的评价与应用

目的 应用聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和多交叉置换扩增(MCDA)4种核酸检测方法,对单增李斯特菌进行检测,探索特异、灵敏、高效,且适用于肉类样本中单增李斯特菌检测的核酸检测方法。方法 比较文献报道的以单增李斯特菌特异性基因lmo0733作为靶标的4种核酸检测方法,评价这4种方法在特异性、灵敏度、检出速率方面的差异,并应用于单增李斯特菌模拟样本和猪肉样本中单增李斯特菌的检测。结果 传统PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法都能准确检测单增李斯特菌,其中MCDA方法检测下限为10 fg/反应,且能在30 min内完成对样本核酸的检测,灵敏度和检出速率优于其它3种核酸诊断方法;MCDA方法对于模拟样本和实际样本的检测效率优于其它3种核酸检测方法和传统分离培养方法,能够提高样本检测的阳性率。结论 MCDA方法作为一种特异、灵敏和高效的核酸检测方法,可用于肉制品中单增李斯特菌检测时的快速筛查,并能提高传统分离培养方法对标本中单增李斯特菌的阳性检出率。     

几种PCR方法在狂犬病毒基因测序中的应用

目的本研究在狂犬病毒全基因测序中应用了RT—PCR法、递减PCR法、嵌套PCR3-法及3’-Full RACE等方法，有效的解决了狂犬病毒在体外扩增时遇到的困难。成功地获得了狂犬病毒野毒株BRV的全基因的eDNA，为实现基因测序及下一步研究工作奠定了理论技术基础。     

基于微流控核酸等温扩增的登革病毒现场快速检测技术研究

[摘要]?目的?结合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和微流控芯片技术,建立一种适合现场快速检测登革病毒的方法。方法?利用RT-LAMP,针对登革病毒基因组中3’非编码区中特异性序列进行扩增,建立基于微流控芯片技术的LAMP检测方法,优化检测体系,并对该方法的灵敏性和特异性进行评估。结果?基于LAMP 和微流控芯片技术的登革病毒检测方法,通过对病毒模板进行扩增,发现与其他病毒无交叉反应,特异性良好;同时,结果显示该方法对登革病毒检测灵敏性可达61.2 pg/μl,与实时荧光定量PCR仪所达到的检测灵敏性一致。结论?基于LAMP和微流控芯片技术的登革病毒检测方法具有操作简单、快速、对设备要求低等优势,并且灵敏性、特异性均较好,是一种便于开展现场快速检测的方法。     

Real-Time PCR for detection of herpes simplex virus without nucleic acid extraction

Background  

The speed and sensitivity of real-time polymerase chain reaction (PCR) have made it a popular method for the detection of microbiological agents in both research and clinical specimens. For the detection and genotyping of herpes simplex virus (HSV) in clinical specimens, real-time PCR has proven to be faster, more sensitive and safer than earlier methods which included isolation of the virus in cell culture followed by immunofluorescence microscopy. While PCR-based assays for HSV detection posses clear advantages over these earlier techniques, certain aspects of the PCR method remain onerous. The process of extraction and purification of nucleic acid from clinical specimens prior to PCR is particularly cumbersome. Nucleic acid extraction is expensive, time-consuming and provides a step whereby specimens can become contaminated prior to their analysis. Herein, we investigate the necessity of nucleic acid extraction from swab-based clinical specimens for HSV detection by real-time PCR. We find that nucleic acid extraction is unnecessary for specific and sensitive detection of HSV in clinical specimens using real-time PCR.     

狂犬病毒新型快速荧光斑点抑制实验方法的建立

目的建立一种新型的快速荧光斑点抑制实验用于狂犬病毒抗体的检测。方法本研究以携带绿色荧光蛋白基因的嵌合狂犬病毒HEP-GFP株为基础毒株,建立了一种新型快速荧光斑点抑制实验(RFFIT-GFP);并对多份人、犬、猫的血清进行了检测,还将该检测结果与传统的RFFIT,ELISA相比较。结果与结论RFFIT-GFP和RFFIT,ELISA测定的结果基本相一致,特异性都比较高,而且RFFIT-GFP是一种比它们更为简便、经济的检测方法。     

Excretion and detection of SARS coronavirus and its nucleic acid from digestive system

AIM: To study whether severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) could be excreted from digestive system. METHODS: Cell culture and semi-nested RT-PCR were used to detect SARS-CoV and its RNA from 21 stool and urine samples, and a kind of electropositive filter media particles was used to concentrate the virus in 10 sewage samples from two hospitals receiving SARS patients in Beijing in China. RESULTS: It was demonstrated that there was no live SARS-CoV in all samples collected, but the RNA of SARS-CoV could be detected in seven stool samples from SARS patients with any one of the symptoms of fever, malaise, cough, or dyspnea, in 10 sewage samples before disinfection and 3 samples after disinfection from the two hospitals. The RNA could not be detected in urine and stool samples from patients recovered from SARS. CONCLUSION: Nucleic acid of SARS-CoV can be excreted through the stool of patients into sewage system, and the possibility of SARS-CoV transmitting through digestive system cannot be excluded.     

幽门螺杆菌hpaA核酸疫苗的构建及免疫原性检测

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因的核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA，应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增hpaA基因，克隆入pUCmT载体，检测hpaA基因序列，经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体plRES，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，通过PCR和酶切反应鉴定。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-hpaA转染COS-7细胞，SDS-PAGE及Western印迹法检测pIRES-hpaA表达HpaA蛋白的免疫原性。结果 成功扩增出长约750bp的hpaA基因．测序结果表明扩增出的hpaA基因与Hp hpaA序列一致，PCR和酶切鉴定结果证实hpaA基因克隆入真核表达载体pIRES，成功构建了含hpaA基因的Hp核酸疫苗pIRES-hpaA，并经Western印迹法检测到特异性蛋白条带。结论 构建了hpaA基因的Hp核酸疫苗，为进一步探索其免疫作用奠定了基础。     

定量PCR检测血清中乙型肝炎病毒DNA及其意义

目的检测血清中乙型肝炎病毒DNA拷贝数,并了解HBV感染的不同血清学指标组合相应的HBV DNA含量分布,以指导临床。方法 采用定量PCR和定性PCR方法,检测216份不同临床类型血清标本的HBV DNA,再用ELISA方法测定HBV-M,统计不同免疫指标组合的HBV DNA平均含量。结果病毒量分为高、中、低三度,大于107拷贝mL-1为高滴度:107-105拷贝mL-1为中等滴度;105拷贝mL-1以下为低滴度。60例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)血清,HBV DNA全部阳性,平均含量为1.9×108拷贝mL-1。51例HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)血清,HBV DNA平均含量为5.4×106拷贝mL-1;33例HBsAg(+)HBeAb(+)血清,HBV DNA平均含量为7.5×105拷贝mL-1;114例HBsAb(+)HBeAb(+)HBeAb(+)血清,HBV DNA平均含量为1.8×105拷贝mL-1。定性和定量PCR阳生率分别为59.3％和61.6％。两种方法相对符合率为94.5％。结论定量PCR可真实反应HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义。     

狂犬病"测毒"泛滥遗害无穷

据《 商报》报道 , 市一工人被邻居家所养宠物犬(犬主声称进行过预防接种 )咬伤 ,全程接种了人用狂犬疫苗 ,后经某县级单位检测其血清抗体 ,报告结果为阴性。该男恐惧 ,遂前往一家省级单位对伤人犬“测毒”(检测带狂犬病毒情况 ) ,检测后伤者被告知犬是“带毒犬”。伤者大惊