豆豉纤溶酶的研究进展

豆豉纤溶酶是从我国豆豉中分离得到的一种蛋白酶,具有良好的溶解血栓作用。文章综述了豆豉纤溶酶产生菌的菌种特性,酶的理化性质、发酵工艺、分离纯化、酶活测定、分子生物学及溶栓实验方面的研究现状,并对其应用和发展前景做了展望。     

纤溶酶产生菌株BS-26的发酵工艺优化

目的对纤溶酶产生菌株BS-26发酵工艺进行优化。方法通过单因素试验和正交试验,确定了摇瓶发酵的最佳条件。结果该菌株产纤溶酶最佳的发酵条件为:3%糊精、1%酵母粉、0.02%CaCl2、0.07%MgSO4,初始pH7.0,接种量为6%,装液量为70/250(mL/mL),摇床温度37℃,转速180 r/min,发酵时间60 h,在该条件下产酶酶活可达593.03 U/mL,是原发酵培养条件下产酶活力的4.5倍。结论此发酵条件可以很好地提高纤溶酶的活力,为发酵规模的扩大奠定了基础。     

豆豉纤溶酶的纯化及其性质研究

由发酵大豆(豆豉)分离纯化一种活性强的纤溶酶,采用硫酸铵盐析,Sephadex G-100和Sephacryl S-200色谱纯化的纤溶酶,在SDS-PAGE上呈一条蛋白带,Mr31000,等电点8.6±0.2.纯化倍数44倍,纯酶比活31020UK/mg,活性回收率68%.由于该酶具有较强的催化纤维蛋白原溶解的作用,因而有望成为一种新型抗血栓药物或预防血栓病的保健食品.     

纤溶酶产生菌的筛选及酶活力的测定

利用纤维蛋白平板法筛选纤溶酶产生菌株并测定其纤溶酶活性。从土壤、豆豉、猪血粉中分别取样,分离到30株具有溶纤活性的菌株,其中来自土壤12株,豆豉10株,猪血粉8株。选择来自土壤,并与已报道的菌株菌落特征不同的34,37菌株号进行研究,测得其酶比活力分别为9.05,624U/mg.Pro。     

豆豉溶栓酶的分离纯化研究

用CM SepharoseFF和Sephadex G-100柱层析法从豆豉提取液中分离纯化出具有体外活性的豆豉溶栓酶,并通过纤维蛋白平板法测定其纤溶活力,发现其具有较强的纤溶能力。     

豆豉中纳豆杆菌的筛选和纳豆激酶的初步分离

利用改良的培养基 纤维蛋白平板法 ,从我国传统食品豆豉中筛选出具有高纤溶活性的纳豆杆菌菌株 ;菌株液体发酵法制得粗酶液 ,采用沉淀法及柱层析等方法从发酵液中初步分离纳豆激酶 ;并应用体外溶栓实验考察分析了纳豆激酶的纤溶活性 ,为开发新型溶栓药物及保健食品提供了实验参考依据     

豆豉纤溶酶生产工艺研究

以筛选得的纤溶酶产生菌——枯草芽孢杆菌HGD107进行15L发酵罐生产豆豉纤溶酶，产物经离心、D392型树脂脱色、盐析、超滤等操作纯化，制得冻干豆豉纤溶酶产品，其比活力为530．6u／mg，纯化倍数11，活性回收率65．7％。     

地衣芽孢杆lw-72合成纤溶酶的摇瓶发酵工艺优化

通过单因素试验和正交试验确定地农芽孢杆菌lw-72摇瓶发酵合成纤溶酶的最佳条件,最佳培养基组成为:玉米粉0.5%、黄豆饼粉2.0%、Na_2HPO_4 0.4%、NaH_2PO_4 0.2%、CaCl_2·2H_2O 0.01%、KCI 0.01%;培养摹初始pH为7.0;最佳培养条件:装液量30 ml/250 ml摇瓶,接种量10%,发酵时间为72 h.在该条件下发酵液中纤溶酶酶活力为622 u/ml,是初始发酵培养基的3.4倍.     

海洋微生物来源纤溶活性化合物的筛选及其分离

目的 从海洋微生物的次生代谢产物中分离具有纤溶促进作用的化合物.方法 采用选择性培养基从海水样品中分离细菌、真菌和放线菌,利用发色底物法筛选产纤溶活性化合物的菌株和确定菌株发酵培养基,通过HPLC分离活性化合物.结果 从离岸100 m处采集的31个海水样品中获得分离菌株936个,从霉菌FG216的次生代谢产物中,发现了具有纤溶促进作用的活性化合物,采用改良的察氏培养基作为发酵培养基,代谢产物的纤溶促进效果最好,并从FG216的发酵液中分离和精制了活性化合物.结论 从海洋微生物的代谢产物中得到了具有纤溶促进作用的活性化合物.     

产纤溶酶海洋枯草芽孢菌的液体发酵条件优化

目的采用响应面法对高产纤溶酶海洋菌株Y-6-A的液体发酵条件进行优化,以进一步提高产酶量并考察该法的有效性。方法先采用单因素实验考查各因素对菌株产酶的影响,并在此基础上利用PlackettBurman设计筛选到影响菌株产酶的主要因素,接着通过最陡爬坡实验逼近酶活最高区域,最后根据Box-Behnken中心组合实验设计对各显著因子进行优化。结果最终得到影响产酶的因素有4个:可溶性淀粉、黄豆粕粉、温度和转速,最佳发酵条件为:可溶性淀粉46.1g/L,黄豆粕粉23.3g/L,温度31.2℃,转速184r·min^-1,在此发酵条件下得到的酶活为3 606.23IU/mL,经3次验证实验测得的酶活稳定在3 580.32±14.82IU/mL,较优化前提高了22.4%,此外,实验值与预测值之间的相对误差为0.63%。结论响应面的优化结果比较理想,经优化后能较好提高酶活。     

白唇竹叶青蛇(Trimeresurus albolabris)毒降纤酶的分离纯化以及性质

目的从白唇竹叶青蛇(T.albolabris)毒中分离纯化无出血作用的降纤活性组分,探讨其理化性质及部分生物功能。方法用DEAE-SephadexA-25,SephadexG-100和CM-SephadexC-50三步色谱法进行分离纯化。SDS-PAGE和HPLC鉴定其纯度和相对分子质量,平板法测定其降纤活性。结果从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化获得单一的降纤组分,能迅速水解纤维蛋白原或纤维蛋白原Aα链,缓慢水解Bβ链,而对γ链无作用,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为56000。EDTA能抑制其纤维蛋白原水解活性,而PMSF、β-巯基乙醇对其活性无影响,提示该组分为单链α金属蛋白酶。结论从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化得到1种无出血作用且降纤活性强的新蛇毒降纤酶。     

中草药桃仁纤溶酶的亲和层析分离

目的分离出高效、特异、安全、不良反应较小的纤溶酶,为溶栓药物的研究奠定基础。方法利用硫铵沉淀法提取出桃仁纤溶酶,测定其比活力,并比较不同蛋白酶抑制剂对桃仁纤溶酶活性的抑制作用,采用亲和层析法对桃仁纤溶酶进行分离纯化。结果亲和层析法分离得到了纤溶酶活性单一组分,比活力为89.08 U.mg？1,比纯化前提高了7.37倍,该组分属于丝氨酸蛋白酶家族。结论利用大豆胰蛋白酶抑制剂作为配基,采用亲和层析法分离桃仁纤溶酶可以得到单一活性成分,且比活力相对提高。     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)纤溶酶PFE的分离纯化

目的从可口革囊星虫中分离纯化纤溶酶,并初步研究其酶学性质。方法实验以纤维蛋白平板法检测纤溶活性,采用匀浆、抽提离心、G-25脱盐、DEAE梯度洗脱等方法从可口革囊星虫中分离纯化出纤溶酶PFE,并进一步研究pH、温度、金属离子及抑制剂对该酶活性的影响。结果分离纯化得到纤溶酶PFE,SDS-PAGE法测得相对分子质量为35kDa左右。此外,其酶学性质研究结果表明:PFE的最适反应pH为7.4,酶活力在pH6.6～9.0时相对稳定;PFE在20～40℃条件下,酶活力保持相对稳定。Fe3+对酶活性有强烈的抑制作用,Ca2+、Mg2+、Fe2+、K+、EDTA和β-巯基乙醇对酶活性均具有一定的抑制作用。结论可口革囊星虫中存在纤溶酶PFE,此酶可直接降解纤维蛋白,具有重要的临床开发价值。     

均匀设计在蚯蚓纤溶酶肠溶片研究中的应用

应用均匀设计研究蚯蚓纤港酶肠溶片的处方和工艺，以片剂酶活力不改变为指标观察处方工艺，成功地获得了使蚯蚓纤溶酶活力基本不改变的肠溶衣片剂最佳处方和工艺。     

重组单环刺螠纤溶酶对大鼠急性心肌缺血的保护作用

目的 研究重组单环刺螠纤溶酶对大鼠急性心肌缺血的保护作用。方法 重组表达单环刺螠纤溶酶,并通过纤维蛋白平板法测定酶活力,体外抗凝试验检测抗凝效果。建立大鼠急性心肌缺血模型,观察并测定重组单环刺螠纤溶酶对大鼠心肌梗死质量比、血清学生化指标[乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate amino transferase,AST）]、凝血指标[凝血酶原时间（prothrombin time,PT）、部分凝血活酶时间（partial thromboplastin time,APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen,FIB）、凝血酶时间（thrombin time,TT）]、组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator,t-PA）及组织型纤溶酶原激活物抑制因子1（tissue plasminogen activator inhibitor,PAI-1）活性的影响。结果 与模型组相比,重组单环刺螠纤溶酶能缩小心肌梗死范围,抑制AST、LDH、CK的升高,延长PT、APTT、TT,降低FIB,降低PAI-1活性,升高t-PA活性,均具有显著性差异（P<0.01）。结论 重组单环刺螠纤溶酶能明显增强纤溶活性,降低凝血时间,说明其抑制凝血系统、活化纤溶系统的作用机制之一可能是抑制血栓形成、抗心肌缺血。重组单环刺螠纤溶酶可有效预防心肌梗死,此结果可为下一步的临床应用提供一定的理论依据。     

一株产纤溶酶菌株BS-26的分离和鉴定

目的对纤溶酶产生菌株进行筛选和鉴定。方法采用LB-纤维蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法进行筛选;通过对菌株形态和生理生化特征以及16S rDNA进行鉴定。结果从土壤中分离得到5株纤溶酶高产菌株,其中菌株BS-26活性最高。其形态和生理生化特征与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)很相近。将所测得的16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析,并用Neighbor-Joining法构建系统发育树。BS-26菌株与Bacillus subtilis的相似性达到99.63%。结论BS-26菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及抗栓活性研究

目的摸索蚯蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶的抗血栓活性。方法采用分步盐析、透析、凝胶色谱和亲和色谱法分离纯化蚯蚓纤溶酶 ;此酶的体内抗栓活性检测采用动静脉旁路血栓形成抑制实验法。结果分离纯化得到的蚯蚓纤溶酶比活高 ,为 16 0 5IU/mg ;蚯蚓纤溶酶的体内血栓形成抑制效果比尿激酶作用显著。 结论该法分离纯化工艺简单 ,特异性好 ,纯化的纤溶酶比活高 ;体内抗栓活性比尿激酶作用显著     

中草药纤溶酶的筛选与鉴定

目的获得具有溶解纤维蛋白能力的中草药。方法选择22种具有活血化瘀功能的中草药,分别进行蛋白质的提取,对蛋白质提取物进行纤维蛋白溶解活性的鉴定。结果10种中草药具有溶解纤维蛋白的能力,作用强弱顺序为肉豆蔻、莪术、益母草、茜草、延胡索、皂角刺、祖师麻、石蒜、九里香、姜黄,其中肉豆蔻纤维蛋白溶解圈最大而且透明。对出现溶圈的蛋白质提取物进行浓度测定,根据尿激酶标准曲线,计算其溶解纤维蛋白的比活力。益母草、延胡索、肉豆蔻、茜草的比活力相对较高,分别为582.43,543.18,480.20和264.52 U/mg。结论建立了筛选具有纤溶酶活性的中草药的方法,并筛选出4种纤溶酶活力相对较高的中草药。     

Fibrinolytic enzyme(s) in western diamondback rattlesnake (Crotalus atrox) venom

Western diamondback rattlesnake (Crotalus atrox) venom has been shown to have significant fibrinolytic activity and no visible fibrinogen clotting activity. The fibrinolytic enzyme(s) estimated by fibrin plate assay, exhibited optimal activity at pH 7·5. Molecular sieve chromatography on Sephadex G-100 revealed that fibrinolytic activity was equally distributed between two protein peaks having mol. wts of 60,000 and 21,500.