阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展

目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体。其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点。     

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

阳离子脂质体的转染机制和影响转染效率的因素

阳离子脂质体以其制备简单、无毒、无免疫原性、可生物降解等优点,成为了近年来基因转移中的常规载体。简述了阳离子脂质体的结构及特性、转染机制、影响转染效率的因素、应用及存在的问题。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

新型阳离子脂质体的制备及其转染效率的测定

目的制备以新型细胞转染素为阳性成分的阳离子脂质体,作为基因载体,用于基因转染的实验研究和肺部疾病的基因治疗.方法用薄膜法制备N4-精胺胆固醇羰酰氨阳离子脂质体,通过电镜观察和电泳,检测其形态、结构和细胞转染条件,并对SPC肿瘤细胞进行转染,评估其转染效率.结果制备的新型阳离子脂质体具有良好的微囊形态,当脂质体∶质粒为(6～8)∶1时,其转染效率可达60%.结论成功制备了新型阳离子脂质体,在适当条件下其具有较高的转染活性,为以后的基因转染和基因治疗打下基础.     

基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较

将外源基因导入真核细胞的方法很多。我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法一脂质体转染法和磷酸钙转染法。研究结果表明：脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导人体外培养细胞内较理想的方法。     

阳离子脂质体的研究进展

基因治疗面临的首要技术问题是基因药物的载体,目前用于基因治疗的载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.病毒载体虽然在基因转移方面具有一定的优点,但在体内具有较大的潜在危险,限制了它在临床基因治疗上的应用.非病毒载体中最具典型的是阳离子脂质体(cationic liposomes)载体,它具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点,近年来备受研究者的重视,至今已有数10种阳离子脂质体被研制合成出来.现就其进展综述如下.     

两种尿激酶脂质体制备方法的比较

作采用去污剂清除技术和逆相蒸发法制备尿激酶脂质体，包裹率分别为２５．６％和２７．７％。负染电镜技术观察ＤＲＴ法制备的脂质体直径６０．４±１３．６ｎｍ，属均匀大单层脂质体；ＲＰＥ法制备的４０．２±２１．０ｎｍ，以小单层为主，均一性较差，经测定尿激酶活性得知，ＬＥＵＫ在４℃和２４℃缓冲液中贮存４８ｈ，仅约１０５ＵＫ自脂质体漏出或活性丧失，在３７℃少含血小板血浆中孵化ＬＥＵＫ，ＵＫ后，均导致ＵＫ活性的     

阳离子脂质体介导BEL-7402、QBC、BXPC-3瞬时转染率比较

目的: 探讨阳离子脂质体瞬时转染消化道肿瘤细胞的差异.方法: 采用pEGFP-N1质粒为报告基因,流式细胞仪技术(FACS)来分析阳离子脂质体介导3种细胞的瞬时转染率,设立裸质粒的转染为空白对照组,将转染的细胞在倒置荧光显微镜下观察并摄像;采用MTT法检测3种细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间和阳离子脂质体介导的转染之间的联系.结果: BEL-7402,QBC,BXPC3 3系细胞阳离子脂质体介导的瞬时转染率分别为26.99%、2.25%和30.36%,BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);3个细胞系裸质粒的转染率分别为0.22%、0.29%和0.18%,3者之间差异无显著性(P＞0.05);BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48 h、64.94 h和26.29 h,QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05).结论: 阳离子脂质体对高度恶性的消化道肿瘤细胞有更好的转染效率.     

HBV DNA疫苗阳离子脂质体复合物转染小鼠实验研究

目的:评价阳离子脂质体作为基因输送载体的效果及初步探讨其作用机理。方法:将二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)与1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)用超声法或挤压法制成阳离子脂质体多片层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SLV)。MLV或SLV与DNA(pS2.S/pFP,1∶1)直接混合形成正负电荷比为3∶1或1∶3的阳离子脂质体/DNA复合物MLV-DNA或SLV-DNA。25只BALB/c平均小鼠分成五组:A,B,C,D,E。分别用4种阳离子脂质体/DNA复合物(A,B,D,E组)和10μg裸DNA(C组)一次性肌肉注射免疫接种小鼠。裸DNA、MLV-DNA(3∶1)和SLV-DNA(3∶1)分别与DNase I反应30 min后,1％琼脂糖凝胶110V电泳2 h分离鉴定DNA。结果:免疫接种后第2周,A组和B组血清转阳率均为40％;免疫接种后第4周,A组和B组血清转阳率均达到100％,并保持至第8周以后。免疫接种后第4周,A组血清平均抗-HBs滴度比对照的C组血清平均抗-HBs滴度高27倍(2.3706,0.9370,P<0.02)。免疫接种8周后,A组和B组小鼠血清抗-HBs水平仍呈上升趋势,平均抗体滴度分别是2.5687,1.9533。D组与E组小鼠血清未见转阳。与DNase温育30 min后,裸DNA(C组)被完全降解,而MLV-DNA(3∶1)和SLV-DNA(3∶1)中DNA基本保持完整。结论:阳离子脂质体是一种高效的非病毒基因输送介质;免疫接种后抗体持续高水平,可能是阳     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

两种不同方法测定糖化血红蛋白的比较

目的比较硼酸亲和层析法（A法）与离子交换高效液相层析法（B法）在测定糖化血红蛋白中的差别,选择一种方便、快捷、准确、适合大批量及自动化的检测方法。方法A法、B法分别采用硼酸亲和层析法和离子交换高效液相层析法,对两种方法的精密度、变异系数、相关性、甘油三酯的干扰等予以评价。结果B法在SD、CV等方面的统计数据优于A法,而两种方法的相关系数r=0．98,表明两种方法有高度的相关性,并且高甘油三酯对两种方法均无明显影响。结论A法人为影响因素大,但是无需特殊仪器,检测时间短,单独标本可随机检测,适合急诊、基层卫生机构的使用。而B法准确度及精密度高,可进行自动化控制,测量速度快。     

叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA在裸鼠体内靶向治疗作用的初步研究

目的研究叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA在神经母细胞瘤裸鼠骨髓、骨转移模型中的靶向性及治疗作用。方法 16只成功建立神经母细胞瘤骨髓、骨转移模型的裸鼠,将其随机分为靶向性研究组（4只）和疗效性研究组（12只）。靶向性研究组裸鼠静脉给予CY3荧光标记叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA,荧光显微镜检测CY3在体内瘤组织及重要器官的荧光强度。疗效性研究组12只裸鼠随机分MYCN siRNA组和无关siRNA组,静脉分别给予叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA与叶酸脂质体包裹的无关siRNA,采用荧光定量PCR检测肿瘤组织MYCN mRNA表达,原位细胞凋亡检测法（TUNEL）观察肿瘤细胞凋亡数。结果 CY3荧光标记的叶酸脂质体MYCN siRNA给药8 h后,荧光主要分布在肿瘤组织内,MYCN siRNA组瘤组织中MYCN mRNA的表达量明显较无关siRNA组降低（P〈0.05）,MYCN siRNA组凋亡细胞数量高于无关siRNA组（P〈0.05）。结论①叶酸脂质体MYCN siRNA经静脉给药后主要靶向瘤组织,叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体;②叶酸脂质体MYCNsiRNA在体内显著下调肿瘤MYCN mRNA的表达,促进肿瘤细胞凋亡,有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。     

超氧化物歧化酶脂质体制备方法包封率的比较

目的 :研究超氧化物酶 ( SOD)脂质体最佳制备方法 ,为进一步研究 SOD脂质体防病、抗衰老的药理作用打下基础。方法 :采用冻融法、逆相蒸发法、钙融合法、逆相蒸发法与钙融合法联合法 ,分别制备 SOD脂质体 ,并对 4种方法的包封率进行了比较。结果 :逆相蒸发法与钙融合法联合制备 SOD脂质体法包封率最大。结论 :逆相蒸发法与钙融合法联合法为最佳制备 SOD脂质体的方法     

脂质体介导寡脱氧核糖核苷酸转染人视网膜色素上皮细胞的转染率及分布测定

目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000 介导的寡脱氧核糖核苷酸(ODNs)在体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中的转染效率及其在细胞中的分布.方法:在阳离子脂质体LipofectamineTM 2000的介导下将人工合成的FAM荧光标记的ODNs转入人RPE细胞中,荧光显微镜下观察转染后20 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h其在细胞内的分布,流式细胞仪检测其在RPE细胞中的转染效率;并用MTT法检测脂质体处理组、脂质体-ODNs复合物处理组和正常对照组的细胞增生活性,观察脂质体的毒性.结果:LipofectamineTM 2000能迅速将FAM-ODNs转入人RPE细胞的胞质和胞核内,4～6 h达高峰,转染效率高达(85.85±5.75)%,与其他时点比较差异有统计学意义(P<0.05),24 h后其转染率还有(70.11±5.81)%;且脂质体对RPE细胞无明显细胞毒性,3组间细胞增生活性比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:LipofectamineTM 2000能有效地将FAM-ODNs转入人RPE细胞中,可作为一种安全有效的基因转移载体用于基因治疗.     

U937单核细胞几种不同转染方法的比较

 目的 采用不同质粒转染方法介导重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒转染U937单核细胞,以获得较高转染效率的方法。方法 分别采用电穿孔法、Effectene转染试剂、Lipofectamine 2000转染试剂、电穿孔+Effectene转染试剂、电穿孔+Lipofectamine 2000转染试剂及HilyMax转染试剂等不同方法介导质粒进行转染,测定不同方法的转染效率、目的基因mRNA表达水平及其对细胞活力的影响。结果 电穿孔+Effectene转染试剂组、电穿孔+Lipofectamine 2000组及HilyMax组的转染效率和目的基因mRNA表达较高,且HilyMax组对细胞活力影响较小。结论 将重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒体外成功转染入U937单核细胞中,通过优化转染方法提高转染效率、降低对细胞活力的影响,为基因治疗提供了实验基础。     

三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究

目的：采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。 方法：分别采用不同剂量（1.25 μl、2.0 μl、2.5 μl）的Lipofec-tamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1 μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。 结果：HilyMax组的转染效率为（86.85%±2.32%）,较Lipofectamin2000组（48.33%±3.24%）、Gbfectene-Elite组（37.35%±5.41%）高（F=18.882,P<0.05）;其中,HilyMax 2.5 μl组的转染效率最高为（90.53%±1.15%）。Lipofectamin2000组的细胞存活率（65.76%±5.78%）明显低于HilyMax组（89.54%±0.86%）、Gbfectene-Elite组（82.45%±3.56%）（F＝90.676,P＜0.05）。 结论：HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5 μl HilyMax：1 μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。     

两种刷牙方法的比较研究

目的本文通过研究两种刷牙法的刷牙压力及牙面清洁效果,为刷牙指导提供科学的依据.方法将106名13～14岁学生随机分为两组,在刷牙测定仪的监测下,一组以旋转法、另一组以短距离横刷法刷牙.分12个牙区记录刷牙前后的菌斑指数和刷牙压力,每1牙区的刷牙时间为15.6S.结果短距离横刷法较旋转法更易去除龈缘区菌斑(P＜0.001),而前者的刷牙压力小于后者(P＜0.001).结论可以认为短距离横刷法是更佳的刷牙方法.     

不同转染法用于第三代慢病毒包装系统包装效率的比较

目的 比较分别经磷酸钙转染法和脂质体转染法建立的第三代慢病毒包装系统的包装效率.方法 制备并纯化完整的重组慢病毒三质粒系统：转移质粒（PXZ171）、包装质粒（△NRF）以及包膜蛋白质粒（VSV-G）.分别用磷酸钙法和脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,72 h后收集病毒上清,批量快速测定法测定病毒滴度并进行比较.结果 磷酸钙转染法所产病毒滴度约达到脂质体转染法的1/10.结论 磷酸钙转染法获取的病毒滴度稍低,但价格相对便宜,病毒产量亦可满足实验要求.比较适合在普通实验室中开展.