肾癌抑制性消减文库构建及差异表达基因鉴定

目的：应用抑制性消减杂交技术筛选人肾癌差异表达基因。方法：以786-0和HK-2为消减杂交对象构建人肾癌抑制性消减文库,挑选阳性克隆进行测序及Genbank BLAST分析。结果：文库包含362个有插入片段的阳性克隆,随机分析50个克隆,其中2个为新基因,另48个源于36个已知基因,这些差异表达基因与肿瘤细胞的转录、翻译、增殖、凋亡、代谢、信号转导、血管新生、膜受体表达异常等有关。结论：该文库质量可靠,筛选出包括低峰度和新基因在内的肾癌差异表达基因,为进一步研究肾癌发生、发展机制奠定了基础。     

肾癌组织消减文库的构建与肾癌特异表达基因克隆

目的 构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,从文中克隆鉴定出肾癌特异性表达的基因奠定基础。方法 应用抑制性消减杂交技术,分别从肾癌及正常肾组织中提取poly(A) RNA;依次合成单链及双链cDNA,分别与2种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR;将产物T／A载体连接接构建成功cDNA消减文库。结果 构成功具有高消减效率的人肾癌组织cDNA消减文库,文库扩增后得到350个阳性克隆,其中95％克隆均含50－400bp插入片段。结论 应用抑制性消减杂交技术所构建的人肾癌组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HCV p7TP2反式调节基因

目的 应用抑制性消减杂交技术筛选HCV p7TP2反式调节基因.方法 采用实时定量PCR验证HCV p7下调p7TP2基因的表达,并应用抑制性消减杂交技术筛选并构建p7TP2下调表达基因的消减文库.用活细胞发光法检测p7TP2基因抑制Huh-7细胞系的增殖.结果 经同源性分析p7TP2下调表达的基因主要位于线粒体,并与细胞凋亡有关.p7TP2 基因转染的Huh-7细胞的活性被显著抑制.结论 p7TP2基因功能的研究为HCV致病机制的研究奠定了基础.     

膀胱移行细胞癌差异表达基因的克隆与鉴定

应用抑制消减杂交(ssH)构建膀胱移行细胞癌差异表达的消减文库，再应用Dot blot方法筛选出差异表达的基因，为研究膀胱癌发生、发展提供实验依据。现报告如下。     

应用抑制性消减杂交方法构建斑秃毛乳头差异表达基因文库

目的：构建斑秃区与正常毛囊毛乳头细胞（DPC）差异表达的cDNA正向和反向消减杂交文库，为从中克隆鉴定出斑秃特异性表达和生长期DPC特异性表达的基因奠定基础。方法：应用抑制性消减杂交技术，分别从斑秃区DPC及正常头皮DPC提取总mRNA；依次合成单链及双链cDNA，分别与2种不同的接头连接，再进行正向和反向的2次消减杂交及2次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库。结论：构建成功具有高消减效率的斑秃区及正常头皮DPC cDNA消减文库，文库扩增后得到120个阳性克隆，其中90个克隆含有100－500bp插入片段，结论：应用抑制性消减杂交技术所构建的斑秃区及正常头皮DPC cDNA消减文库，为进一步批量筛选，克隆斑秃区及正常头皮DPC特异性表达的基因奠定了基础。     

肾癌差异表达基因GYLZ-RCC18的全长克隆及意义

目的 克隆并鉴定肾癌与下沉肾组织之间差异表达的基因。为研究肾癌发生发展机制提供新的突破口。方法 应用抑制性消减杂交技术,构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的ｃＤＮＡ消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌特异表达的基因。结果：构建成功高消减效率的人肾癌组织ｃＤＮＡ消减文库,对其中１０个克隆的插入ｃＤＮＡ片段进行测序后,经基因库检索表明１０个片段均为未知新序列,其中ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８基因为５个拷贝,这提示以上１０个ｃＤＮＡ片段可能来自６个新基因。差异分析显示ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８的肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,应用ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ技术获得ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８基因的全长,并证明ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８是一个５′端有Ｄ３种不同剪切方式亚型的基因家族。结论 ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８基因是肾癌特异表达的新基因。人肾癌ｃ     

抑制性消减杂交分析肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质基因在膀胱癌中的表达下调

目的：分析膀胱移行细胞癌的差异表达基因，探讨肿瘤行为的分子生物学基础及筛选有效的肿瘤标记。方法：应用抑制性消减杂交（SSH）方法构建在正常膀胱组织和膀胱癌组织中差异表达序列的消减文库，用差异筛选技术分离差异表达基因。结果：从消减文库中共获得了9个在正常膀胱组织中高表达、在膀胱癌组织中表达下调的基因，分别属于细胞外基质成分和肌动蛋白细胞骨架体系。结论：细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架体系中相关基因的表达下调可能反映了肿瘤细胞在细胞粘附、细胞间相互作用、迁移及运动等诸多过程中的异常，可能与癌细胞的侵袭和转移密切相关，对发展成为膀胱癌的分子标记物具有潜在价值；gelsolin、tuopomyosin等抑癌基因在膀胱癌形成过程中可能起了重要作用。     

原发性肝细胞癌消减杂交文库构建及差异表达基因筛选

目的构建人原发性肝细胞癌（HCC）消减杂交文库，筛选差异表达基因。方法以癌组织为检测者（tester）、癌旁组织为参照者（driver），应用抑制性消减杂交（SSH）方法构建消减杂交cDNA文库，随机挑选56个阳性克隆进行鉴定、测序及同源性分析。结果文库获得130个阳性克隆，鉴定96％有200～1500bp插入片断。获得的35个基因中包括已知基因26个，功能未知基因5个，新基日4个。已知基因中包含酶、细胞信号转导、基因调控因子、转录调节因子、癌基因、抗凋亡因子及细胞的黏附与生长调节因子等相关基因。结论应用SSH方法成功构建HCC差异表达基因cDNA文库，筛选出低丰度和新基因在内的HCC差异表达基因。     

利用抑制消减杂交筛选瘢痕疙瘩差异表达基因

目的 利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术，比较瘢痕疙瘩与正常皮肤组织之间基因表达差异，筛选瘢痕疙瘩特有的差异表达基因片段，为揭示瘢痕疙瘩的病因提供实验依据。方法提取瘢痕疙瘩与正常皮肤组织细胞mRNA，逆转录成cDNA。以瘢痕疙瘩cDNA为检测子，正常皮肤组织细胞cDNA为驱动子，选择四碱基内切酶RsaI将cDNA酶切；连接特殊设计的接头进行消减杂交和PCR反应，得到消减混合物，与T载体连接，转化DH5a感受态细菌，建立差异消减文库。Southern杂交筛选鉴定差异基因，进行测序和同源分析。结果经SSH筛选、Southern杂交鉴定得到13个瘢痕疙瘩差异表达基因，其中已知功能的基因11个，如TA结合因子1、E4基因转录因子1、ephrinB2型受体基因、血小板生长因子受体基因等；有与肿瘤发生有关的基因，如G抗原7基因等；未知功能基因2个。结论筛选得到的瘢痕疙瘩差异表达基因，对了解瘢痕疙瘩发生发展的病因学基础和指导临床治疗具有重要意义。     

创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞差异表达cDNA文库的构建

目的：研究创伤早期伤口液作用前后真皮多能干细胞基因表达的变化,探讨真皮多能干细胞参与创伤修复启动的分子机制。方法：取伤后1d伤口液作为创伤修复启动微环境,刺激真皮多能干细胞,24h后提取总RNA为实验方(tester),未予刺激的真皮多能干细胞总RNA为驱动方(driver)。实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA方法合成cDNA,然后用抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物。消减杂交产物克隆到T载体构建消减文库。对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果：消减杂交文库挑取615个克隆进行PCR扩增,阳性率约为97%。取其中48个克隆进行反向Northern杂交,获得5个差异表达基因。经Genebank检索,这些差异表达基因与已知序列有较高同源性,其中大多为与创伤修复相关的基因。结论：我们成功构建了创伤早期伤口液刺激前后大鼠真皮多能干细胞差异表达cDNA文库,并筛选、克隆出部分与真皮多能干细胞参与创伤修复相关的差异表达基因。     

膀胱癌患者尿脱落细胞抑制消减文库的构建及差异基因的初步筛选

目的 应用抑制性消减杂交方法 筛选膀胱移行细胞癌患者与正常人尿脱落细胞差异表达基因.方法 分离膀胱移行细胞癌患者与正常人尿液中总mRNA,用SMART技术反转录成cDNA,经过酶切、接头连接、两轮消减杂交及两轮抑制性PCR,使得差异表达的DNA片段得以富集.PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌XL-blue构建差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后随机挑取克隆进行酶切、测序及同源性分析.结果 PCR鉴定有317个克隆载有主要在200～900bp之间呈随机分布的插入片段,片段插入率达93.2%,证实建库成功.对20个质粒测序结果 经同源性比对分析,其中20个片段源于17个已知基因,1个克隆在GenBank中未检索到与其有相似性的基因序列,表明它们可能为BTCC差异表达的新基因.结论 该消减杂交文库质量町靠,它的成功构建为进一步筛选、克隆膀胱肿瘤差异表达基因提供了依据.也为膀胱肿瘤诊断基因芯片的研究与开发奠定了基础.     

用SSH方法构建BTCC患者尿脱落细胞差异表达基因的cDNA消减文库

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)方法构建膀胱移行细胞癌(BTCC)患者与正常人尿脱落细胞差异表达基因cDNA消减文库。方法:分别从BTCC患者与正常人尿液中提取总mRNA,用SMART技术反转录成cDNA,经过HaeⅢ酶切后将BTCC尿脱落细胞cDNA分为两组并接上接头,再与过量正常膀胱尿脱落细胞cD-NA进行两轮消减杂交及两轮抑制性聚合酶链反应(PCR),使得差异表达的DNA片段得以富集。PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌JM109构建成差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后,随机挑取克隆进行酶切、测序及同源性分析。结果:PCR鉴定有317个克隆载有主要在200～900bp之间呈随机分布的插入片段,片段插入率达82.6%,证实建库成功。对20个质粒测序结果经同源性比对分析,其中20个片段源于17个已知基因,1个克隆在GenBank中未检索到与其有相似性的基因序列,表明它们可能为BTCC差异表达的新基因。结论:该消减杂交文库质量可靠,其成功构建为进一步筛选、克隆BTCC差异表达基因提供了依据。     

应用cDNA RDA联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的方法学分析

目的探讨采用cDNA代表性差异分析法（representational difference analysis，RDA）联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的可行性及局限性。方法将17β雌二醇（E2）干预MG-63细胞cDNA分别制备成检测和驱赶扩增子进行消减杂交作为整个cDNA RDA的内部质控，以干预组扩增子、对照组扩增子和第4轮双向消减产物为模板，行内对照基因GAPDH的RT-PCR进行消减效率分析，Southem杂交证实消减产物来源，快速Northern杂交证实消减产物确实呈差异表达；克隆到pGEM-Teasy载体，转化JM109感受态细菌并铺Amp^＋／X-gal／IPTG琼脂皿得到差异表达文库，随机挑取白色单菌落培养后点成尼龙阵列膜，分别与干预组和对照组扩增子及第4轮消减产物杂交，得到差异表达克隆用于后续研究。结果内部质控结果显示，第3轮消减杂交后，PCR未见差异性产物扩增；cDNA RDA共得到3个雌二醇诱导表达上调条带和2个表达下调条带。Southern杂交结果显示在检测扩增子及第1～4轮差异产物中均可见阳性杂交信号，而驱赶扩增子中无杂交信号；快速Northern杂交证实干预组细胞总RNA的两处杂交信号均较对照组强；阵列膜同一克隆两个点对应的杂交信号呈高度相关一致性，共得到120个差异表达克隆（56个表达上调，64个表达下调）。结论cDNA代表性差异分析法联合cDNA阵列点杂交方法能有效快速高通量筛查E2诱导MG-63差异表达基因。     

cDNA微阵列和抑制消减杂交技术筛选胃癌下调功能基因组的研究

目的 筛选胃癌下调基因组，发现新的胃癌下调基因。方法 采用cDNA微阵列技术，检测5例胃癌与相对应正常胃粘膜间mRNA表达差异基因，筛选胃癌下调基因组。采用抑制消减杂交技术，建立5人份正常胃粘膜mRNA抑制消减杂交胃癌mRNA的差异表达文库，用聚合酶链反应及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其消减效率。随机挑选阳性克隆测序，寻找胃癌下调新基因，并经逆转录-聚合酶链反应证实。结果 筛选到60个胃癌下调基因，其中包括抑癌基因，凋亡相关基因，DNA复制、转录、翻译相关基因，细胞周期相关基因，细胞迁移相关基因等。克隆到两个胃癌下调的新基因片段。结论 得到60个胃癌下调基因，它们共同作用与胃癌的发生、发展、转移密切相关。成功建立了用于筛选胃癌下调新基因的抑制消减杂交cDNA文库，发现了两个新的胃癌下调基因片段．     

肾癌抑制性消减杂交文库的构建及意义

目的　应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织间差异表达的cDNA组成的消减文库。　方法　分别从肾癌组织和正常肾组织提取polyA RNA ,合成双链cDNA ,经RsaI酶切后将肾癌cDNA分为两组并加上不同的DNA接头 ,再与过量正常肾组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌构建成cDNA消减文库 ,文库扩增后随机挑取克隆进行酶切、测序及同源性分析。　结果　文库共包含 4 14个阳性克隆 ,随机挑取 2 6 5个阳性克隆提取质粒并酶切分析 ,其中 2 4 6个克隆有插入片段。将其中 4 0个克隆进行测序 ,表明 1个克隆为新基因片段 ,其余 39个源于 35个已知基因。　结论　该消减杂交文库质量可靠 ,它的成功构建为进一步筛选、克隆肾癌差异表达基因提供了依据     

转化生长因子β_1刺激肝星状细胞差异表达下调基因筛选

目的筛选并克隆转化生长因子β1(TGF-β1)刺激肝星状细胞差异表达下调基因,阐明TGF-β1导致肝纤维化的分子生物学机制。方法以TGF-β1及磷酸盐缓冲液分别刺激大鼠肝星状细胞(即实验组和对照组),提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将对照组细胞cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与实验组细胞cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建了TGF-β1刺激肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到98个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。选取含有插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得了19种已知基因序列和2个未知功能基因。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF-β1刺激的肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明TGF-β1参与肝纤维化的分子生物学机制提供了理论依据。     

抑制性消减杂交技术克隆肾癌差异表达基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人吕组织与正常肾组织差异表达的ｃＤＮＡ消减文库，并从中克隆鉴定出蛑癌特异性表达的新基因。方法 分别从肾癌及正常肾组织中提取ｍＲＮＡ并合成ｃＤＮＡ，经酶切后将肾癌ｃＤＮＡ分为两组，分别与两种不贩接头衔接，再与正常肾组织（ｃＤＡＮ）进行两次的消减杂交及两次抑制性ＰＣＲ产物与Ｔ／Ａ载体连接构建成功ｃＤＮＡ消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆进行酶切、测序分析     

肺鳞癌肿瘤相关基因的验证和分析

目的 分析人肺鳞癌组织和正常肺组织中差异表达的肿瘤相关基因的表达状况,探讨其在肺癌发生、发展中的作用。方法 对经抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)获得的部分阳性克隆的差异表达基因,采用半定量RT-PCR方法在12例肺鳞癌标本中进行验证;对其中的部分新基因进行Northern Blot检测。结果 共获得10个差异表达基因片段,其中6个为已知基因片段,2个为结构已知但功能未知的基因片段,2个可能为新基因EST片段(GenBank登录号：C20／AF363068;C34／AY032661)。经检测,包括新基因AY032661在内的6个基因在肺鳞癌肿瘤组织中表达下调;包括新基因AF363068在内的4个基因在肺鳞癌肿瘤组织中表达上调。结论 所分析的差异表达基因均与肿瘤的发生和机体的免疫机制有关。     

改良消减杂交法在多种肿瘤细胞凋亡相关基因克隆中的应用

目的　应用基于聚合酶链反应 (PCR)技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤凋亡相关基因。方法　以全反式维甲酸 (ATRA ,1× 10 -5mol/L)诱导前列腺癌DU 14 5细胞、早幼粒白血病HL 6 0细胞和乳腺腺癌MCF 7细胞产生凋亡 ,在此基础上 ,采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤细胞凋亡相关基因。结果　在维甲酸 ( 1× 10 -5mol/L)诱导前列腺癌DU 14 5细胞、早幼粒白血病HL 6 0细胞和乳腺腺癌MCF 7细胞产生凋亡过程中 ,有肿瘤坏死因子、泛素、热休克蛋白和C erbB 2基因参与 ,并成功克隆出 3条可能与凋亡密切相关的未知基因 ,均被GenBank收录 ,登录号为AF174394、AF14 4 0 5 6、AF14 1882。结论　这种基于PCR技术的改良消减杂交方法对于差异表达基因的克隆是十分有效的。