地塞米松促进大鼠颅骨成骨细胞向脂肪细胞转分化

目的 研究在不同浓度地塞米松作用下,体外培养的大鼠颅骨成骨细胞能否转分化为脂肪细胞,以进一步探讨糖皮质激素性骨质疏松症发病的具体机制.方法 将原代培养的大鼠颅骨成骨细胞分为四组,分别用含不同浓度的地塞米松(0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L)的DMEM(H)培养基培养.于作用后第7天、21 d,采用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,进行细胞化学染色(茜素红钙结节染色、油红O染色),并采用实时荧光定量RT-PCR检测PPARγ-2、LPL及ALP基因mRNA的表达.结果 在10-6、10-7mol/L的地塞米松作用下,大鼠成骨细胞矿化能力减弱,胞浆中出现脂滴,RT-PCR结果显示脂肪细胞标志基因PPAR(γ)-2、LPL mRNA表达增高,成骨细胞标志基因ALP mRNA表达减少.而10-8mol/L地塞米松对成骨细胞的分化有促进作用.结论 长期、大剂量应用糖皮质激素可促进大鼠颅骨成骨细胞转分化为成熟的脂肪细胞,这可能是糖皮质激素性骨质疏松症的发病机制之一.     

地塞米松对人牙髓细胞增殖分化影响的研究

目的观察地塞米松对体外培养的人牙髓细胞增殖和分化的影响。方法收集拔除的无龋坏、无牙周疾病的健康前磨牙及第三磨牙,获得牙髓,酶消化联合组织块法体外培养人牙髓细胞(Human dental pulp cells,hDPCs),扩增后取第4代生长状态良好的细胞用于实验。分为两组,实验组hDPCs在含2%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的αMEM培养基中加入10-8mol/L地塞米松(Dexamethasone,Dex)培养,对照组单纯使用含2%FBS的αMEM培养基培养。在细胞培养第1、3、5天检测细胞增殖情况;细胞培养的第1、5、10天分别进行ALP染色及ALP定量分析检测细胞分化情况;细胞培养第10天进行茜素红染色观察钙化结节形成情况。结果细胞增殖活性检测显示,实验组培养第3天及第5天可见hDPCs增殖活性得到显著抑制,与对照组相比有统计学差异;ALP染色及定量测定:培养10 d后,地塞米松实验组ALP活性明显高于对照组;茜素红染色结果:培养10 d后两组细胞茜素红染色均为阳性,表明实验组与对照组均有钙化结节形成,但是实验组钙化结节形成数量较多。结论酶消化联合组织块法可以成功体外培养hDPCs。10-8mol/L地塞米松可显著抑制hDPCs的增殖活性,提高hDPCs的ALP活性及矿化能力。     

不同浓度地塞米松诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究

目的地塞米松是MSCs成骨诱导分化的基础试剂,探讨诱导脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化过程中地塞米松的优选浓度,为进一步骨组织工程研究提供理论依据。方法 3月龄清洁级健康新西兰大白兔5只,雌雄不限,体重2～3 kg。取腹股沟区皮下脂肪4～6 mL,采用胶原酶消化离心贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化;联合CD44、CD106免疫荧光染色和成脂诱导分化鉴定ADSCs。调整细胞密度为1×105个/mL,分别用普通培养液(A组)及含0(B组)、1×10-9(C组)、1×10-8(D组)、1×10-7(E组)、1×10-6(F组)、1×10-5 mol/L(G组)地塞米松的成骨诱导培养液对ADSCs进行培养。MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞骨钙素(osteocalcin,OC)和核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)的表达;测定ALP活性及矿化面积百分率;对矿化结节行茜素红染色。结果 ADSCs形态多为梭形、多角形,呈"漩涡状"排列;表面抗原分子CD44呈阳性,CD106呈阴性,成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O染色呈阳性。MTT检测显示随地塞米松浓度升高,吸光度(A)值呈下降趋势;其中成骨诱导5、7 d时,D、E组A值比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测示,成骨诱导7 d OC和Cbfα1 mRNA的表达分别在E组和D组达高峰;成骨诱导14 d ALP活性和矿化面积百分率均在D组达高峰,随后逐渐下降。D、E组间OC和Cbfα1 mRNA的表达量、ALP活性及矿化面积百分率比较差异均无统计学意义(P>0.05),与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。成骨诱导14 d,G组细胞均死亡;茜素红染色除A、G组外均呈阳性。结论成骨培养液中地塞米松浓度为1×10-8 mol/L时,能在减少对细胞增殖抑制的同时,更有效地诱导ADSCs成骨分化。     

辛伐他汀对人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的:研究辛伐他汀对人牙髓干细胞(dental pulpstem cells,DPSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:将第3代人DPSCs在矿化培养液中诱导培养,同时加入不同浓度的辛伐他汀(1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L),噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,茜素红染色鉴定成骨分化。结果:各浓度辛伐他汀均抑制人DPSCs增值,辛伐他汀浓度为1×10-5mol/L时,抑制作用最明显。适宜浓度辛伐他汀(1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L)促进人DPSCs向成骨细胞分化,其中,1×10-7mol/L的辛伐他汀促进ALP活性的作用最明显。结论:辛伐他汀抑制人DPSCs的增值,适宜浓度的辛伐他汀可有效促进人DPSCs的成骨分化。     

不同剂量和作用时间地塞米松对大鼠骨密度和成骨细胞作用的研究

目的观察地塞米松(Dex)不同剂量及不同作用时间对大鼠骨量、成骨细胞的影响。方法 120只3月龄SD雌性大鼠,随机分对照组(生理盐水)、小剂量组(地塞米松1 mg/kg)、中剂量组(地塞米松2.5 mg/kg)、高剂量组(地塞米松5 mg/kg),每组30只,2次/周肌内注射,分别干预4 w、9 w、12 w。给药前及干预后采用双能X线骨密度仪测大鼠全身骨密度(BMD),免疫组化法检测骨组织碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白表达。从新生SD大鼠颅骨体外分离培养成骨细胞,随机分为5组:空白对照组、5×10-8mol/L Dex组、5×10-7mol/L Dex组、5×10-6mol/L Dex组、5×10-5mol/L Dex组,分别培养12h、24 h、48 h后,采用CCK8法检测成骨细胞增殖,采用RT-PCR检测成骨细胞ALP mRNA、I型胶原mRNA表达。结果 (1)干预4 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度与对照组无差异(P0.05)。干预9 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P0.05),高剂量组大鼠骨密度低于小剂量组(P0.05);干预12 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P0.05),且随着剂量的增加,大鼠的骨密度逐渐降低。(2)干预4 w,ALP、I型胶原蛋白表达与对照组无差异(P0.05);干预9w,中剂量和高剂量组大鼠骨组织I型胶原蛋白表达均低于对照组(P0.05),不同剂量组大鼠骨组织ALP蛋白表达均低于对照组(P0.05);干预12 w,大鼠骨组织ALP、I型胶原蛋白表达均低于对照组(P0.05);随着Dex剂量的增加,大鼠骨组织ALP及I型胶原蛋白表达逐渐降低。(3)体外分离培养成骨细胞干预12 h,5×10-6mol/L Dex和5×10-5mol/L Dex均抑制成骨细胞增殖(P0.05),5×10-5mol/L Dex组成骨细胞的ALP、I型胶原mRNA表达减少(P0.05);干预24 h及48 h,不同浓度Dex均明显抑制成骨细胞增殖(P0.05),ALP、I型胶原mRNA表达明显减少(P0.05),呈剂量和时间依赖性。结论地塞米松可能通过抑制成骨细胞的增殖及骨形成,导致SD大鼠骨密度降低。     

地塞米松调节骨髓基质细胞成脂及成骨分化的研究

目的　观察激素对骨髓基质细胞脂肪特异性基因aP2mRNA及成骨基因Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法　以地塞米松 (1× 10 -7mol/L)作为诱导剂 ,采用完整细胞斑点印迹分子杂交方法检测实验组和对照组中aP2和Ⅰ型胶原mRNA表达。结果　实验组aP2mRNA含量4847.7± 40 6 .4明显高于对照组 15 7.6± 10 .8,其Ⅰ型胶原mRNA含量 44 2 .3± 5 7.8明显低于对照组 5 35 3 .6± 36 4.6。结论　地塞米松能够从基因调控水平诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化 ,减少其向成骨细胞分化 ,这可能与激素性骨坏死的发病机制有关。     

骨形成蛋白-2和牙胚细胞联合作用诱导人牙周膜干细胞表达成牙骨质细胞的表型研究

目的:探讨大鼠牙胚细胞(Tooth germ cells,TGC)与骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic proteins-2,BMP-2)联合作用对人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)向成牙骨质细胞表型分化的作用。方法:将免疫磁珠法分离的hPDLSCs与TGC共培养,并加入50ng/mL的BMP-2,通过RT-PCR,茜素红染色和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测等方法分析其相关成牙骨质基因及蛋白的表达变化。结果:诱导后hPDLSCs的ALP活性明显升高(P0.001),牙骨质细胞相关基因如牙骨质附着蛋白(Cementum attachment protein,CAP)、牙骨质蛋白(Cementum protein1,CEMP-1)、ALP,骨钙素(Osteocalcin,OCN)的转录水平表达量均有不同程度的增高(P0.001)。矿化诱导14d后,诱导组形成大量矿化结节,与对照组相比具有统计学意义(P0.001)。结论:TGC与BMP-2联合作用能够诱导hPDLSCs与向成牙骨质细胞的表型分化。     

辛伐他汀对老年大鼠骨髓基质干细胞成骨和成脂分化的影响

目的 从细胞和基因水平探讨辛伐他汀对老年大鼠骨髓基质干细胞成骨和成脂分化的影响.方法 18月龄雄性SD大鼠的骨髓基质干细胞进行成骨和成脂诱导培养,培养介质中加入辛伐他汀(10-6、10-7、10-8 mol/L和10-9 mol/L),同时设溶剂对照组.成骨检测:碱性磷酸酶(ALP)染色和定量,茜素红矿化染色和定量,ALP和骨钙素(OC)基因分析;成脂检测:油红脂肪细胞染色和定量,脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶增殖活化受体(PPARγ2) 基因分析.结果 在含有低剂量地塞米松的成骨诱导条件下,辛伐他汀随浓度增加促进了细胞基质的矿化,增强了ALP的活性及染色,提高了ALP和OC的基因表达(若无地塞米松,辛伐他汀则无法单独诱导成骨,此结果 未展示);同时,辛伐他汀随浓度增加减弱了脂肪细胞的油红染色,抑制了LPL 和PPARγ2的基因表达.显著性差异皆发生于10-6 mol/L和10-7 mol/L辛伐他汀组.结论 辛伐他汀随浓度增加抑制了老年骨髓基质干细胞的成脂分化,并中等强度地促进了老年骨髓基质干细胞的成骨分化.这表明辛伐他汀具有促进骨合成代谢的作用,可以用于治疗常见的骨代谢疾病,如增龄性的骨质疏松症.     

胰岛素样生长因子-1对成纤维细胞向成骨细胞转化的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-1对成纤维细胞(Fb)向成骨细胞转化的影响. 方法 Fb来源于成年新西兰大白兔,通过分离、纯化、培养而得到.实验分为3组:空白对照组、成骨诱导组和实验组.空白对照组:常规培养液培养,不加入任何诱导剂及干预因子;成骨诱导组:成骨诱导液为常规培养液中加入浓度为1×10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠;实验组:成骨诱导液中加入终浓度为50 ng/mL的IGF-1.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞增殖情况,检测各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,测定各组细胞培养后6d后的骨钙素含量,采用钙钴染色评价培养后2周的成骨能力.结果 实验组细胞增殖较其他两组旺盛,差异有统计学意义(P＜0.05),而空白对照组和成骨诱导组差异无统计学意义(P＞ 0.05).ALP活性和骨钙素测定:实验组ALP表达明显高于其他两组,差异有统计学意义(P＜0.05);成骨诱导组ALP表达高于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).实验组钙化结节数量明显较其他两组多,成骨诱导组次之,空白对照组未见钙化结节.结论 胰岛素样生长因子-1可以促进Fb在成骨过程中的增殖以及增加其成骨能力.     

股密葆含药血清对高浓度地塞米松干预后成骨细胞增殖分化作用的影响

目的：观察股密葆含药血清对高浓度地塞米松干预后成骨细胞增殖分化的影响.方法：用多次酶消化法分离出生24 h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,P1代细胞进行实验.将不同浓度地塞米松（0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L）干预成骨细胞,1周后进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色,3周后进行矿化结节染色.根据上述实验结果,进一步选择10-5 mol/L地塞米松干预成骨细胞1周,继而改换空白鼠血清及高、中、低浓度股密葆含药血清培养基,培养1周后进行ALP染色,Western-blot检测Ⅰ型胶原及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达,培养2周后进行矿化结节染色.结果：生理浓度地塞米松（10-8 moL/L）可促进成骨细胞ALP的表达及矿化结节产生,而高浓度地塞米松（10-7～10-4 mol/L）可抑制上述结果,股密葆含药血清可逆转高浓度地塞米松对成骨细胞ALP、矿化结节、Ⅰ型胶原及PCNA的抑制作用.结论：高浓度地塞米松可抑制成骨细胞增殖分化,而这种抑制作用可被股密葆含药血清逆转.     

辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响

目的：研究辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响.方法：将体外分离培养的人牙髓干细胞分别接种于含有不同浓度辛伐他汀的矿化培养液中诱导培养,测定碱性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表达情况.结果：与对照组比较,适宜浓度辛伐他汀（1×10^-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）促进人牙髓干细胞的成骨活性作用更为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）,当辛伐他汀浓度为1×10-7mol/L时,促进作用最显著.结论：适宜浓度的辛伐他汀可以有效促进人牙髓干细胞的成骨活性.     

葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化的作用

目的:探讨葛根素对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化的影响。方法:向体外培养的hPDLSCs中分别加入0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作为实验组,另设阳性对照组和空白组。MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性影响,采用免疫荧光法、碱性磷酸酶(alkaline phosphotase,ALP)试剂盒、茜素红染色及qRT-PCR对葛根素作用后hPDLSCs生物学特性作初步观察。结果:0.01mmol/L葛根素可明显促进hPDLSCs增殖,免疫荧光染色显示实验组I型胶原蛋白(collagen-I,COL-I)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)均阳性表达;与空白组对比,实验组诱导7天后ALP活性升高,14天后茜素红染色见矿化结节形成,qRT-PCR检测ALP和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)分别在加药后7天和14天表达上调。结论:葛根素能够促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化。     

不同浓度胰岛素对毛乳头细胞的生物学作用的研究

目的：了解不同浓度胰岛素对毛乳头细胞的生物学作用。方法：人头皮组织分离、培养、获得毛乳头细胞,根据胰岛素浓度分为1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol/L3个组,设无胰岛素培养液为对照组。应用不同浓度胰岛素的2%新生牛血清培养液培养毛乳头细胞3天,分别用MTT法测定毛乳头细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定毛乳头细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力。结果：与对照组比较,1×10^-8、1×10^-7mol/L胰岛素组毛乳头细胞增殖、抗凋亡及迁移能力显著增加（P〈0.05或P〈0.01）,且1×10^-7mol/L组作用最强（P〈0.05或P〈0.01）。结论：1×10^-8～1×10^-7mol/L胰岛素可以增强毛乳头细胞增殖、迁移和抑制凋亡的作用。     

地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的 探讨地塞米松对体外培养的骨髓基质细胞增殖和分化等生物学特性的影响。方法 取4－6周龄新西兰兔双侧股骨骨髓3ml,体外分离,培养至第3代骨髓基质细胞,分别用地塞松浓度为0、10^10、10^-9、10^-8、10^-7和10^-6mol/L的培养基,作用2、4、及6天后,测定骨髓基质细胞的分裂增殖能力和碱性磷酸酶活性。结果 地塞米松对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用,并随地塞米松浓度的升高而增强,其浓度大于10^-8mol/L后抑制作用越显著。地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性,浓度越高作用也越显著,但超过10^-8mol/L后各浓度的作用效果无显著差别;这种作用随时间的延长而增强,至6天时与对照组相比可增强2－4倍。结论 地塞米松抑制骨髓基质细胞的增殖,但可促进其分化成骨细胞, 浓度为10^-8mol/L较合适。     

脱氢表雄酮在体外对成骨细胞代谢和IL-1β的影响

目的探讨脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）对离体大鼠成骨细胞和IL-1β的影响。方法体外分离培养大鼠成骨细胞,取传一代细胞,分别给予10^-5mmoL／L、10^-7mmoL／L、10^-9mmol／LDHEA培养72h,以10^-8mmoL／L雌二醇（estradiol,E2）为阳性对照,另设空白对照组。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色鉴定成骨细胞,MTT法检测成骨细胞的增殖能力,PNPP法测定ALP活性。ELISA法测定不同浓度DHEA培养液中IL-1β的水平。结果不同浓度DHEA组成骨细胞增殖能力和ALP的活性均有上升,其中以10^-7mmoL／LDHEA组最显著（P〈0．01）,其作用和E2相似（P〉0．05）;10^-9mmoL／LDHEA组单位细胞数的ALP活性高于空白对照组（P〈0．05）。不同浓度的DHEA组IL-1β呈下降趋势,成骨细胞增殖能力及ALP活性和IL-1β成负相关。结论DHEA在体外促进大鼠成骨细胞生长和增殖,提高ALP活性,其作用可能和抑制IL-1β有关。     

Genistein对乳腺癌细胞致成骨细胞生物学功能改变的影响

目的 探讨Genistein对乳腺癌细胞致成骨细胞(osteoblast, OB)增殖、分化和矿化功能的影响,观察Genistein在乳腺癌骨转移的病理条件下是否能调节OB生物学功能.方法 源于大鼠颅盖骨的原代OB与50%来自人源性乳腺癌细胞系MDA-MB-231或MCF-7的条件培养基(conditioned medium,CM)共同培养,并加入5×10-7 mol/L (G7)、5×10-8 mol/L (G8)或5×10-9mol/L (G9) 的Genistein进行干预.MTT法观察其对OB增殖的影响;PNPP偶氮法观察其对OB碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性的影响;茜素红S(ARS)进行矿化结节染色并计算面积以观察其对OB矿化能力的影响.结果 MDA-MB-231和MCF-7细胞条件培养基可显著抑制OB的增殖.用Genistein干预1 d、3 d和5 d后,OB增值率可有不同程度的提高,差异有统计学意义(P<0.05).此外,乳腺癌细胞条件培养基可明显下调OB的ALP活性,而用不同浓度的Genistein干预后,OB的ALP活性分别较MDA-MB-231和MCF-7细胞条件培养基组增加22.7%、32.4%、63.5%和27.7%、32.0%、58.3%(P<0.05).Genistein还可改善乳腺癌细胞条件培养基对OB矿化能力的抑制,增加OB形成的矿化结节面积.结论 在乳腺癌骨转移的病理条件下,Genistein可促进OB的增殖、分化和矿化能力,改善乳腺癌细胞对OB生物学功能的抑制作用.     

奥曲肽对人结肠癌细胞生长增殖抑制作用的研究

目的研究不同浓度的生长抑素类似物奥曲肽对人结肠癌SW480细胞生长增殖的抑制作用。方法体外培养人结肠癌SW480细胞,MTT比色法测定不同浓度奥曲肽抑制SW480细胞增殖作用,以效价强度最高者为最佳抑制浓度;平皿集落形成法测定奥曲肽抑制体外培养SW480细胞的锚定依赖性生长作用。结果不同浓度奥曲肽对SW480细胞增殖活性具有不同程度的抑制作用,在1×10^-10～1×10^-8mol/L浓度范围内呈剂量依赖性,其中1×10^-8mol/L为最佳抑制浓度;奥曲肽对SW480细胞锚定依赖性生长具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。结论奥曲肽能抑制体外培养的人结肠癌SW480细胞生长增殖,并在一定范围内呈浓度与时间依赖性。     

AcSDKP对人真皮成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的：探讨N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）对人真皮成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。方法：人真皮成纤维细胞的原代培养及鉴定后,给予不同浓度AcSDKP（10-7,10-8,10-9,10-10,10-11mol/L）的干预,设立空白对照组。WST-8法检测人真皮成纤维细胞增殖;RT-PCR技术检测人真皮成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果：与空白对照组相比,10-10mol/LAcSDKP抑制人真皮成纤维细胞增殖作用最强;10-8mol/L和10-9mol/LAcSDKP对Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的抑制作用最显著。结论：本实验发现AcSDKP能够抑制人真皮成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,有望为病理性瘢痕的防治提供新方法。