结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及形态学观察

目的:观察原代培养的结膜松弛症(CCH)球结膜成纤维细胞生长状况及形态变化,确定最佳传代时间以获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。方法:采用组织块贴壁法获得CCH原代球结膜成纤维细胞,胰蛋白酶差速消化法进行成纤维细胞纯化,倒置显微镜下观察并记录不同时期成纤维细胞的生长状况及形态变化,免疫荧光细胞化学染色行成纤维细胞鉴定。结果:CCH结膜组织贴壁24h即可见少量细胞从组织块周围爬出,第2～7d为细胞生长对数期,细胞生长快、增殖旺盛,轮廓清晰,分布均匀,数目增多,细胞核清晰;第9～15d细胞生长进入平台期,组织块逐渐老化失去活性,细胞增长缓慢,排列疏松,体积变大,形状扁平,细胞浆内见大量颗粒状物质和小泡产生,部分细胞从培养瓶底脱落,细胞之间出现较大空隙。传代纯化后细胞的大小、形态基本一致,经鉴定为成纤维细胞,呈长梭形、扁平星状或多突的纺锤形,中间宽大,有卵圆形细胞核,两头相对细小,伴向外伸出2～3个长短不一的细长突起。结论:采用组织块贴壁法可成功获得原代CCH球结膜成纤维细胞,当细胞生长至第8d时行消化、传代可获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。     

杞精明目汤颗粒剂对肿瘤坏死因子-α刺激下结膜松弛症成纤维细胞MAPK信号通路的影响

目的　观察肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激下,杞精明目汤颗粒剂对结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCH）结膜成纤维细胞表达丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）的影响,探讨CCH的发病机制及有效治疗策略。方法　体外培养CCH结膜成纤维细胞,分为CCH组、CCH+TNF-α组及CCH+TNF-α+杞精明目汤组。CCK-8确定杞精明目汤颗粒剂有效浓度,用含10^-2 mg·L^-1的TNF-α刺激培养的成纤维细胞,加入杞精明目汤颗粒剂干预48 h,分别采用ELISA、Western Blot和RT-PCR检测MAPK信号通路相关蛋白及mRNA的表达,并行统计学分析。结果　CCK-8确定杞精明目汤颗粒剂有效浓度为1.61 g·L^-1。三组MAPK信号通路相关分子细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）、p38 MAPK及其磷酸化水平的吸光度（A₄₅₀）值总体差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且TNF-α可明显上调CCH表达ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK（均为P<0.05）,而杞精明目汤可显著下调TNF-α刺激后的CCH成纤维细胞表达ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK（均为P<0.05）。三组p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白总体差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且TNF-α可明显上调CCH成纤维细胞p-ERK1/2、p-JNK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达（均为P<0.05）,杞精明目汤可显著下调TNF-α刺激后的CCH成纤维细胞表达p-ERK1/2、p38 MAPK（均为P<0.05）。三组ERK1/2、p38 MAPK mRNA表达总体差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且TNF-α可明显上调CCH成纤维细胞ERK1/2、p38 MAPK mRNA的表达（均为P<0.05）,杞精明目汤可显著下调TNF-α刺激后的CCH成纤维细胞p38 MAPK mRNA表达（P<0.05）。结论　TNF-α可上调CCH成纤维细胞MAPK信号通路的表达,导致CCH的发生发展,而杞精明目汤颗粒剂在一定程度上可下调MAPK信号通路的表达从而发挥治疗作用。     

杞精明目汤联合人工泪液对结膜松弛症临床疗效及细胞衰老的影响

目的：观察中药杞精明目汤联合人工泪液对结膜松弛症(CCH)的临床疗效及细胞衰老的影响。

方法：收集40例80眼Ⅱ～Ⅳ级肝肾阴虚型CCH患者,随机分为联合治疗组(杞精明目汤联合人工泪液治疗)和人工泪液组(单纯人工泪液治疗),观察国际眼表疾病指数(OSDI)、泪膜破裂时间(BUT)、基础泪液分泌试验(SⅠt),治疗3mo后比较临床治疗效果。对于CCH分级在Ⅲ级及以上,随访3mo及以上并有手术意愿的CCH患者切除松弛结膜组织,冰冻切片行细胞衰老相关的β-gal染色观察,结果行统计学分析。

结果：治疗3mo后联合治疗组的OSDI评分(14.53±2.68分)、BUT(9.25±3.02s)、SⅠt(8.95±3.57mm/5min)均显著优于人工泪液组(P<0.05)。药物治疗后采取手术治疗的CCH患者人工泪液组为7例7眼,联合治疗组为4例4眼,且联合治疗组衰老阳性细胞计数显著低于人工泪液组(16.00±7.84个 vs 39.00±14.09个,P=0.013)。

结论：杞精明目汤联合人工泪液治疗CCH在缓解眼部症状、改善泪膜、促进泪液分泌方面,较单纯人工泪液治疗更为有效。联合治疗还可以减少CCH的细胞衰老,可作为除手术治疗之外安全、有效的治疗方案。     

基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在结膜松弛症成纤维细胞中的表达

目的探讨基质金属蛋白酶1、3（MMP．1、MMP．3）及其组织抑制因子1、3（TIMP-1、TIMP．3）在结膜松弛症（CCh）成纤维细胞培养上清液中的表达,揭示四者表达水平变化与CCh的内在联系。方法体外原代培养CCh成纤维细胞,取第3—6代细胞,以2．5×10^5个／mL浓度接种于24孔板中培养,24h后提取细胞上清液,采用ELISA检测MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3的表达水平。不同组间比较采用单因素方差分析。结果MMP-1的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。MMP-3的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。TIMP．1的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度与正常对照组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。TIMP-3的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度明显低于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成纤维细胞MMP．1／TIMP-1及MMP-3／TIMP-3的表达失衡可能参与了CCh的发生、发展。     

结膜松弛症超微结构电镜研究

目的观察结膜松弛症患者球结膜成纤维细胞超微结构改变,探讨其发病机制.方法对4例松弛结膜组织和2例对照组结膜组织,用透射电镜观察球结膜超微结构改变.结果结膜松弛症组表现为成纤维细胞的胞质中有较多扩张的粗面内质网和游离核糖体,胞质外周区有较多衣小泡和吞饮泡.而上皮层超微结构与对照组相比,差异无显著性.结论结膜松弛症中结膜成纤维细胞的改变,影响细胞外基质成分的平衡,可能是结膜松弛症发生的原因.     

结膜松弛症球结膜及筋膜组织的超微结构观察

背景 结膜松弛症(CCh)手术治疗中观察到球结膜变薄、弹性下降、张力降低,筋膜萎缩;组织病理学检查发现CCh球结膜弹力纤维减少、胶原纤维融解.但目前对CCh球结膜超微结构的研究较少.目的 探讨CCh球结膜变薄、筋膜萎缩的发病机制,对CCh和正常球结膜组织进行透射电子显微镜观察.方法 收集5例CCh松弛结膜组织为CCh组,5例正常球结膜组织为正常对照组,用透射电子显微镜观察其各层组织超微结构改变.结果 CCh组球结膜固有层成纤维细胞数量减少,外形呈长梭形,胞突细长,核-质比增大;胶原原纤维紊乱、分散、断裂,并出现局灶性溶解缺失.CCh组筋膜层成纤维细胞呈线形,胶原原纤维严重缺失.结论 CCh患者球结膜固有层及筋膜组织中胶原原纤维减少、成纤维细胞变性.     

结膜松弛症患者球结膜成纤维细胞的培养和鉴定

目的研究组织贴壁法原代培养结膜松弛症球结膜成纤维细胞,并对细胞进行鉴定,为结膜松弛症体外实验提供大量的细胞。设计实验研究。研究对象体外培养的人结膜松弛症球结膜成纤维细胞。方法以结膜松弛症患者手术切除的球结膜为材料,采用组织贴壁法培养细胞,胰酶消化、传代,并对细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定、流式细胞术检测成纤维细胞胞浆特异性蛋白的表达。主要指标细胞形态、结构、纯度。结果组织块贴壁法原代培养2～5天见组织块能紧密贴附于六孔板,倒置显微镜下观察组织块周围有细胞溢出,10～15天即可见细胞增生,细胞呈马赛克样,界线不清。传代至第2代细胞倒置显微镜下观察形态一致,大小均一,呈放射状排列,为长梭形或两头尖的长条状,胞质中有一个卵圆形的细胞核,周围有长短不等的细胞突起相互交联。细胞免疫化学染色,荧光显微镜下可见结膜松弛症球结膜成纤维细胞Vimentin表达阳性,Keratin(C11)表达阴性。流式细胞术检测成纤维细胞Vimentin表达阳性,Keratin(C11)表达阴性。结论采用组织贴壁法培养能够获得稳定的结膜松弛症球结膜成纤维细胞,经形态学观察、免疫荧光鉴定及流式细胞术检测为结膜松弛症球结膜成纤维细胞。     

兔结膜成纤维细胞培养的体会

兔结膜成纤维细胞培养的体会河北省人民医院张坤丽，张淑惠，杨树立，张渤海近年来，抗眼部增生性疾病的研究已进入抑制细胞增殖的药物研究领域，其中，体外抗成纤维细胞药物测试则成为一种重要的研究工具［１，２］。本文就我们培养兔结膜成纤维细胞的体会介绍如下。材料...     

结膜松弛症球结膜杯状细胞研究

目的观察结膜松弛症球结膜杯状细胞的组织病理学及超微结构改变。方法对10例松弛球结膜组织和10例正常对照组球结膜对应区组织,采用PAS和AB染色,对照观察组织病理及超微结构改变。结果结膜松弛症球结膜上皮中的杯状细胞密度为(2.75±2.68)/100个上皮细胞,对照组为(4.64±3.25)/100个上皮细胞,2组间差异无统计学意义(t=1.42,P=0.17)。随着结膜松弛症程度加重,球结膜杯状细胞密度降低,Ⅰ级(3.90±2.40)/100个上皮细胞,Ⅱ级(2.96±0.72)/100个上皮细胞,Ⅲ级(2.05±0.86)/100个上皮细胞,Ⅳ级(1.33±0.96)/100个上皮细胞。结膜松弛症球结膜上皮细胞层有鳞状化改变,细胞层数较厚,为4～15层,固有层很薄,电镜观察结膜松弛症杯状细胞胞质内大量浆液性分泌颗粒,线粒体少。而正常对照组球结膜上皮层较薄,为4～5层,电镜观察杯状细胞胞质中有黏液小滴,并有丰富的线粒体,杯状细胞顶端有微绒毛。结论结膜松弛症中球结膜杯状细胞数量减少,形态及超微结构有异常。     

结膜松弛症的治疗研究现状

结膜松弛症是老年人常见眼病,患者常有流泪、干涩、异物感等症状,严重影响生活质量.药物治疗主要是人工泪液等的对症治疗.药物治疗无效时可考虑结膜新月形切除术、结膜缝线固定术、结膜切除羊膜移植术、角膜缘结膜梯形切除术、结膜双极电凝术、下睑缘张力减弱术等手术治疗方法.需根据患者的情况、结膜松弛症分级而选择不同的手术方法,适宜的手术治疗对结膜松弛症是安全、有效的.     

结膜松弛症结膜组织及泪液中黏蛋白的表达变化

目的:观察结膜松弛症松弛结膜组织和泪液中黏蛋白的表达变化,探讨结膜松弛症的发病机制.方法:收集结膜松弛症组38例38眼和正常对照组36例36眼的结膜组织和泪液标本,分别行免疫组织化学染色检测结膜组织中黏蛋白(MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC16)表达情况,ELISA检测泪液中黏蛋白(MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC16)A值,结果行统计学分析,比较两组之间的差异.结果:结膜松弛症组的结膜上皮细胞中MUC2、MUC4与正常对照组表达无统计学差异 (P=0.315、0.156);结膜松弛症组的结膜上皮细胞中MUC5AC、MUC16阳性表达细胞较正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P=0.016、<0.01).结膜松弛症组泪液中MUC2的A值与正常对照组无统计学差异(P=0.651),结膜松弛症组中MUC4、MUC5AC的A值较正常对照组明显降低,有显著的统计学差异(均P<0.01),结膜松弛症组中MUC16的A值较正常对照组下降,差异有统计学意义(P=0.022).结论:结膜松弛症患者结膜组织和泪液中MUC5AC和MUC16均下降,对其进一步研究可能揭示结膜松弛症的发病机制.     

Expressions of matrix metalloproteinases 1 and 3 and their tissue inhibitors in the conjunctival tissue and fibroblasts cultured from conjunctivochalasis

AIM: To investigate the expression of matrix metalloproteinases 1 and 3 (MMP-1 and MMP-3) and their tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 3 (TIMP-1 and TIMP-3) in the conjunctiva of eyes with conjunctivochalasis (CCh). METHODS: The conjunctival tissue was obtained from the CCh patients and controls, the MMPs/TIMPs expression concentration was determined by enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA) and immunofluorescence staining. The expression levels of MMPs/TIMPs in the CCh fibro-blasts were determined by analyzing its concentration in the cellular supernatant that was abstracted from the in vitro cultured CCh fibroblasts. RESULTS: MMP-1 and MMP-3 levels determined by ELISA were both significantly higher in the CCh group than that in the control group (P=0.042, 0.022, respectively), so was the levels of TIMP-1 (P=0.010). No significant difference in the expression of TIMP-3 in conjunctiva was found between the two groups (P=0.298). The expression of MMP-1 and MMP-3 were both up-regulated significantly in the CCh group (P=0.040, 0.001, respectively) on immuno-fluorescence staining. MMP-1 and MMP-3 expression in the fibroblasts were both significantly higher in the CCh group than that in the control group (P=0.027, 0.001, respectively), while neither the TIMP-1 nor TIMP-3 expression was significantly different between the two groups (P=0.421, 0.237, respectively). CONCLUSION: The overexpression of MMP-1 and MMP-3 in conjunctival tissue and fibroblasts may play an important role in the pathogenesis and development of CCh.     

结膜松弛症的发病机理研究

结膜松弛症的发病机理是出现了球结膜、泪液和睑缘三者平衡失调,眼表自动反馈调节系统失灵。球结膜组织发生以弹力纤维减少为主要的组织病理改变,泪液中出现蛋白质及酶的异常表达,在瞬目或闭眼时下睑缘张力增高向上推压已经过度变薄、弹性下降、张力降低、与其下方组织结合疏松的球结膜,松弛结膜就会明显堆积在下睑缘上、内、外眦部之间,形成皱褶,突出于眼表曲面,影响泪液的流动、分布、排泄,在松弛结膜上不能形成正常泪膜,而发生干燥、充血、水肿、上皮角化、泪河变窄或残缺不全,泪液不能正常流动到泪湖区,泪湖不能聚泪,泪液不能进入泪点,使泪液排泄出现障碍,泪液清除延缓又可导致大量降解酶的堆积,可能使胶原纤维溶解,弹力纤维变性,引起眼表泪液学异常的病理循环,而发生结膜松弛症。     

带蒂结膜瓣移植联合MMC治疗翼状胬肉合并结膜松弛症

目的：探讨带蒂结膜瓣移植联合丝裂霉素治疗翼状胬肉合并结膜松弛症的疗效。 方法：对翼状胬肉合并结膜松弛症患者122例156眼进行翼状胬肉切除,下方带蒂结膜瓣移植联合术中使用0.2g/L丝裂霉素C。 结果：患者122例156眼术后2mo眼部症状有不同程度改善。泪河恢复正常者136眼（87.18％）;泪膜破裂时间（BUT）≥10s者117眼（75.00％）;裂隙灯显微镜检查眼球与下睑缘、内外眦部之间无松弛结膜皱褶者147眼（94.23%）;下睑缘位置正常者142眼（91.03%）。手术后观察6mo~4a,胬肉复发5眼（3.21%）,结膜松弛复发15眼（9.62%）。 结论：翼状胬肉切除术中,下方带蒂结膜瓣移植联合术中使用丝裂霉素C治疗翼状胬肉合并结膜松弛症,手术简单易行,取材容易,安全可靠,损伤小,并发症少,复发率低,适合临床开展。     

结膜松弛症的病理学研究进展

结膜松弛症是指球结膜过度松弛和(或)下睑缘张力高,造成松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘、内外眦部之间形成皱褶引起眼表泪液学异常,并伴有眼部不适症状的疾病。临床并不少见,易被误为正常老年性改变而被忽略。近年来在其病理学方面研究取得了较大进展。本文对结膜松弛症的临床表现及分级、组织病理学特点,超微结构改变,发病机制及尚待解决的问题作一扼要综述。     

结膜松弛症定量定位切除术的临床疗效观察

目的:为了寻求安全、简便、经济、有效切除结膜松弛症的手术方法,评价结膜松弛症定量定位切除术和新月形切除术的临床疗效。方法:采用前瞻性随机分组对照研究方法,将2008-01/2009-05在上海中医药大学附属普陀医院眼科按照结膜松弛症诊断标准入选手术治疗患者30例30眼按患者入选编号末位数的奇偶数随机分为两组。奇数组行结膜定量定位切除术15例15眼;偶数组行结膜新月形切除术手术15例15眼。手术后第2,4,8wk分别随访患者症状改善程度,裂隙灯观察结膜松弛症变化情况,测量泪河、BUT,氯霉素眼液尝味试验。结果:结膜松弛症定量定位切除仪和结膜新月形切除术组术后4wk,两组症状改善有效率均为87%,无差异。结膜定量定位切除术松弛结膜完全消除,占87%;结膜新月形切除术组松弛结膜完全消除,占73%,差异无统计学意义(χ2=0.833,P=0.361)。结膜定量定位切除术后4wk泪河恢复正常者,占87%,BUT≥10s者,占73%,氯霉素眼液尝味试验阳性者,占53%。结膜新月形切除术后4wk泪河恢复正常者,占73%(χ2=0.833,P=0.361),BUT≥10s者,占67%(χ2=0.159,P=0.690),氯霉素眼液尝味试验阳性者,占60%(χ2=0.136,P=0.713),差异均无统计学意义。结论:结膜松弛症定量定位切除术安全、简便、准确、有效,更适合手术经验不足的医师开展。     

结膜松弛症治疗进展

结膜松弛症是由于球结膜过度松弛和/或下睑缘张力高,造成松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘,在内外眦部之间形成皱褶,引起眼表泪液学异常,并伴有眼部干涩、异物感、泪溢等眼部不适症状的疾病。近年来,国内眼科医生逐渐对这一疾病提高了认识,其治疗手段亦得到越来越多的重视和应用。结膜松弛症的严重程度决定了其不同的治疗方法。症状不明显的结膜松弛症不需治疗;眼部刺激症状严重者,可以给予药物治疗;而保守治疗无效,或是对于Ⅲ～Ⅳ级结膜松弛严重的患者,则选择手术治疗。结膜松弛症的手术方法多种多样,但要达到最好的治疗效果,应该权衡各种方法的利弊,掌握其适应证。我们对结膜松弛症的这些治疗方法及其优缺点、适应证,以及近年来的研究进展进行综述。     

结膜松弛症研究新进展

结膜松弛症是年龄相关性老年性常见眼病,随着人口老龄化加快,患者日趋增多。下睑缘张力高、睑板腺功能障碍及结膜淋巴流动阻塞可能是结膜松弛症诱发因子之一。自身免疫性甲状腺疾病患者结膜松弛症发病率高。结膜松弛症患者球结膜杯状细胞减少,并有形态及超微结构异常表现。结膜松弛症泪液分泌减少,泪膜稳定性下降,泪液中黏蛋白减少,出现调节凋亡相关蛋白质和防御素。细胞凋亡和炎症可能是结膜松弛症发病的原因。结膜松弛症发病机制认为是泪液中IL-1β,IL-6,肿瘤坏死因子-α等炎性因子增加,使结膜成纤维细胞中MMP-1,3,9过度表达,使得MMPs与TIMPs之间失去平衡,可能使胶原纤维融解,弹力纤维变性减少,导致球结膜基质和Tenon囊的过度降解,引起眼表泪液异常的病理循环,而发生结膜松弛症。纤维蛋白胶应用于结膜松弛症手术中,电凝治疗结膜松弛症及开展上方结膜松弛症手术治疗。     

The role of elastic fibers in pathogenesis of conjunctivochalasis

The PubMed, MEDLINE databases and China National Knowledge Infrastructure (CNKI) were searched for information regarding the etiology and pathogenesis of conjunctivochalasis (CCh) and the synthesis and degradation of elastic fibers. After analysis of the literature, we found elastic fibers was a complex protein molecule from the structure and composition; the degradation of elastic fibers was one of the histopathological features of the disease; the vast majority of the factors related to the pathogenesis of CCh ultimately pointed to abnormal elastic fibers. By reasonably speculating, we considered that abnormal elastic fibers cause the conjunctival relaxation. In conclusion, we hypothesize that elastic fibers play an important role in the pathogenesis of CCh. Studies on the mechanism of synthesis, degradation of elastic fibers are helpful to clarify the pathogenesis of the disease and to find effective treatment methods.