结核杆菌ESAT-6抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达flt3配体(flt3-ligand,FL)和结核杆菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)的重组pIRES质粒,并在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中表达,为进一步研究结核杆菌DNA疫苗提供实验基础.方法:采用PCR方法将FL和ESAT-6基因分别定向克隆入真核双表达载体pIRES.在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至GMC细胞,Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,该重组质粒在体外GMC细胞中能表达FL和ESAT-6两种蛋白.结论:成功构建了结核杆菌FL和ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达.     

ＰＩ３-Ｋ／Ａｋｔ ｓｈＲＮＡ真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对P13-K/Akt基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体.方法:用DNA重组技术将针对大P13-K/Akt基因不同位点所设计的8个shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中.在酶切分析及序列测定后,用脂质体染至大鼠肾小球系膜细胞(GMCs).Western blot检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及酸序列分析证明重组质粒正确.Western blot证实在重组质粒中shPik3c3-2、shAktl-4具有最佳沉默效率.结论:成功构建了PK/Akt shRNA的真核表达质粒.该实验结果为进一步研究P13-K/Akt信号通路的生物学功能奠定了基础.     

大鼠野生型Gadd45γ基因和Gadd45γ shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型Gadd45γ基因和其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Gadd45γ基因的情况.方法:用DNA重组技术将针对大鼠Gadd45γ基因的cds区序列或针对其不同位点所设计的4对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/HA或pGCsi.U6.neo.GFP中.在酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTM Ⅲ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMCs中,用免疫细胞化学和Western blot检测HA-Gadd45γ融合蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及核酸序列分析证明两种重组质粒均构建正确.免疫细胞化学和Western blot分析表明构建的pcDNA3.1/Gadd45γ质粒在大鼠GMCs中能够表达;Gadd45γ shRNA-3具有最佳沉默效率.结论:成功构建了大鼠野生型Gadd45γ基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,该实验结果为进一步研究Gadd45γ基因的生物学功能奠定了基础.     

结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定

目的:构建含有6个编码结核杆菌抗原HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位基因序列的重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:选取结核杆菌抗原Rv0309、Rv0173、Ag85A、Ag85C的6个HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,引入Th表位PADRE及木马肽序列,并以RVKR序列作为接头,合成全基因序列,经 PCR扩增后插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹鉴定重组表达蛋白.结果:成功构建了结核杆菌多表位蛋白的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为40 000的融合蛋白.结论:多表位融合蛋白的重组表达为进一步开发新型结核疫苗打下了基础.     

壳聚糖纳米化的结核杆菌ESAT-6和FL重组DNA疫苗对小鼠产生Th1和Th2型细胞因子的影响

目的:探讨壳聚糖纳米包被的结核杆菌早期分泌性抗原(6 kd early secretory antigenic target,ESAT-6) 与fms样酪氨酸激酶3配体 (fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FL)重组DNA疫苗接种C57BL/6小鼠对其Th1和Th2型细胞因子生成的影响?方法:制备壳聚糖(nano-chitosan,CS)纳米颗粒,然后用CS纳米粒包被本室构建的结核杆菌ESAT-6与FL重组质粒(nano-ESAT-6-FL)?ESAT-6质粒(nano-ESAT-6)?FL质粒 (nano-FL)和pIRES载体(nano-pIRES),并进行电镜和Western blot鉴定?此后将上述质粒分别接种小鼠,同时给小鼠接种未用壳聚糖纳米颗粒包被的上述对应质粒,并设PBS?CS纳米粒及BCG作为对照?接种后9周,取小鼠脾细胞进行培养,并用结核菌纯化蛋白衍生物 (purified protein derivatives tuberculin,PPD) 给予刺激72 h,然后用ELISA试剂盒检查小鼠脾细胞上清液中的Th1型细胞因子(IFN-?酌 ?IL-12)和Th2型细胞因子(IL-4?IL-10)的分泌水平?结果:成功制备出壳聚糖纳米包被的结核杆菌ESAT-6和FL重组质粒(包括其他几种质粒),并证实被壳聚糖纳米包被的质粒可在真核细胞中表达?用壳聚糖纳米包被的ESAT-6-FL重组质粒免疫小鼠,其脾细胞上清液中的IFN-?酌和IL-12水平显著高于未用壳聚糖纳米包被的相应质粒免疫组和其他对照组,而IL-4和IL-10的水平与未用壳聚糖纳米包被的相应质粒免疫组和其他实验组对照组相比均无明显升高?结论:壳聚糖纳米化的ESAT-6-FL重组质粒疫苗接种小鼠能够显著提高小鼠体内Th1型细胞因子的水平?提示用壳聚糖纳米包被结核杆菌ESAT-6-FL重组DNA疫苗能提高其细胞免疫效果?     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

李斯特菌载体结核疫苗候选株基因重组构建及蛋白表达验证

目的 基因重组构建以单增李斯特菌、绵羊李斯特菌为载体的新型结核疫苗候选株,并进行蛋白表达验证,为结核疫苗研究和结核防控提供新思路和新方法。方法 以体外基因连接、质粒转化等技术,将本实验室已有的分别编码结核抗原Ag85C、ESAT-6蛋白的两种基因盒,插入携带单增李斯特菌、绵羊李斯特菌同源序列的打靶质粒中。将打靶质粒电转化单增李斯特菌、绵羊李斯特菌,在42 ℃和30 ℃连续传代,利用同源重组杂交原理和基因打靶技术,将打靶质粒携带的两种编码结核抗原的抗原基因盒,分别整合至致病基因（actA和plcB）被敲除的单增李斯特菌、绵羊李斯特菌减毒株及未经减毒的绵羊李斯特菌基因组中。重组菌经蓝白斑、抗生素抗性及PCR筛选,再经Western blot检测其菌体蛋白及分泌蛋白的表达情况。结果 构建了携带抗原基因盒的重组菌株5株,其重组基因序列PCR验证结果均符合预期,且测序验证成功;重组菌不携带红霉素抗性基因,表型特征符合预期;其中,重组菌Li-Rv0129c、Li-ΔactAplcB-Rv0129c按预期表达了结核杆菌Ag85C抗原蛋白,Li-ΔactAplcB-Rv3875按预期表达了结核杆菌ESAT-6抗原蛋白,Lm重组菌未表达相应结核抗原蛋白。结论 成功构建并筛选得到3株以绵羊李斯特菌为载体的、携带结核杆菌Rv0129c（编码Ag85C）抗原基因盒或Rv3875（编码ESAT-6）抗原基因盒,且表达相应抗原蛋白的新型结核疫苗候选株。     

人类免疫缺陷病毒１型病毒复制负调控因子编码基因的克隆及在ＢＣＢＬ-１细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达

目的:分离克隆人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Nagative factor,Nef)基因,并将其导入BCBL-I细胞和NIH/3T3细胞中进行表达.方法:根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5'端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点;以含有Nef基因的pCINL质粒为模板,扩增Nef基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pCI-neo中.为了便于蛋白检测,在下游引物5'端引入Flag序列,构建重组真核表达质粒.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后分别瞬时转染BCBL-I细胞和NIH/3T3细胞,用RT-PCR、Western blot分别从核酸和蛋白水平检测Nef基因的表达情况.结果:成功构建了含Nef基因的重组真核表达质粒,核酸序列分析显示,克隆的Nef基因序列全长651 bp,与GenBank中登记的Nef基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Western blot都在Nef预期位置检测到特异性条带.结论:HIV-1 Nef基因在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中获得了正确表达.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

结核杆菌保护性抗原-遍在蛋白质系统的建立

目的：将结核杆菌4种保护性抗原基因与小鼠遍在蛋白质（泛素）基因融合，建立抗原－遍在蛋白质系统。方法：通过RT－PCR技术从小鼠睾丸组织中克隆遍在蛋白质cDNA，同时培养结核杆菌并从基因组中克隆出4种保护性抗原编码区，然后通过柔性接头将遍在蛋白质与4种抗原的基因分别融合在一起，并插入到pVAX质粒中。结果：扩增出来的4种抗原基因大小分别为0.3,0.7,1.0,1.65kb，遍在蛋白质PCR产物约为0.2kb，均与GenBank中登录的相符；pVAX重组质粒酶切结果显示融合基因正确地插入到pVAX载体中，全自动测序显示抗原基因和遍在蛋白质基因均为所需基因，柔性接头序列也完全正确。结论：成功地构建了中国株结核杆菌的4种保护性抗原基因－遍在蛋白质融合系统，为结核病的防治打下了基础。     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6 的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因
装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染
Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫
小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6 特异性抗体IgG 的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;
ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,
测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处
见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组
（空质粒组和生理盐水对照组）明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对
照组（空质粒组和生理盐水对照组）。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细
胞免疫和体液免疫效应。
     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况?方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中?在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6 shRNA?结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功?Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率?结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础?     

结核杆菌特异性抗原对结核病诊断价值研究

目的从人血清提取结核杆菌早期分泌性抗原靶6、培养滤液蛋白、结核杆菌分泌蛋白38KD进行标测,探讨结核病诊断新方法。方法选择我院2007年1月～2008年1月间住院肺结核病人和健康查体者,应用结核分枝杆菌相关性抗原ESAT-6、CFP10、38KD检测试剂盒测定血清结核菌抗原水平,同时对所有入选者均行结核菌培养。结果活动性肺结核患者血清中检测到结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP10、38KD的阳性率高,与健康对照组有统计学差异（P〈0．005）;结核分枝杆菌抗原可区分结核感染和非感染,与结核菌素试验比较有显著的统计学差异（P〈0．001）。结论血清结核杆菌特异性抗原能够作为诊断结核病的依据,对鉴别活动性肺结核、非活动性肺结核、非结核病具有重要的价值。     

大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his-A和pGCsi.U6.neo.GFP中。经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确。Westernblot分析表明,构建的pcDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具。     

大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。