伴MYC、BCL2和(或)BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤在弥漫大B细胞淋巴瘤中的发生率

目的探究伴MYC、BCL2和(或)BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的发生率。方法回顾性收集2013年1月至2020年8月共922例DLBCL患者的临床资料,检测C-MYC及BCL2蛋白表达情况,并应用FISH技术检测MYC、BCL2和BCL6基因断裂及拷贝数变化等结构异常。结果922例DLBCL病例中,29例(3.15%)检测到MYC、BCL2和(或)BCL6基因断裂,其中25例为双重打击淋巴瘤(DHL),14例为MYC合并BCL2基因断裂,11例为MYC合并BCL6基因断裂;4例为三重打击淋巴瘤(THL)。以C-MYC表达≥40%、BCL2表达≥50%作为阳性阈值时,541例(58.68%)患者同时高表达C-MYC和BCL2;以C-MYC表达≥70%及BCL2表达≥50%作为阳性阈值时,52例(5.64%)患者同时高表达C-MYC和BCL2。DHL患者中,22例C-MYC表达≥40%且BCL2表达≥50%,其中9例C-MYC表达≥70%且BCL2表达≥50%。709例患者检测了P53蛋白表达,其中101例(14.25%)为突变型,13例(1.83%)为阴性,提示可能存在大片段缺失。结论伴MYC、BCL2和(或)BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤在DLBCL中的发生率较低,基因结构异常与蛋白高表达之间无明显相关性;DHL的检出依赖分子遗传学检测。     

急性髓系白血病BCL2L10基因启动子区异常甲基化定量研究

目的:定量研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中BCL2L10基因启动子区异常甲基化状态,探讨其与AML的临床关系.方法:应用焦磷酸测序法,对62例原发AML患者的骨髓进行BCL2L10基因启动区甲基化水平的定量检测,并以10例缺铁性贫血和巨幼细胞性贫血的骨髓标本及10例健康人外周血标本作为对照.结果:62例AML中32例标本BCL2L10基因启动区高甲基化,阳性率为51.6％,而20例对照组中1例标本BCL2L10基因启动区高甲基化,阳性率为5.0％;BCL2L10基因在AML患者中的高甲基化阳性率显著高于对照组(P＜ 0.01);BCL2L10基因的甲基化状态与AML患者的年龄、性别及临床分型间均未出现显著相关性(P＞0.05).结论:BCL2L10基因启动子区异常甲基化在AML中普遍存在,其可能是引起AML的分子机制之一.     

应用多重RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法检测儿童白血病常见融合基因

本研究探讨基因芯片在儿童白血病8种常见融合基因检测中的应用。采用多重巢式RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法对84例临床收集的白血病标本进行融合基因检测。结果表明：此芯片可以从患者骨髓样本RNA中准确检测到阳性参照序列以及与融合基因相对应的特异基因片段。84例白血病患者骨髓标本中,31例（36．90％）具有8种染色体结构畸变产生的融合基因。包括te1／am11、e2a／pbx1、bcr／ablp190、bcr／ablp210、m11／af4、am11／eto、pm1／rarα、cbfβ／myh11。芯片检测的敏感性及特异性和RT—PCR方法相当。结论：采用多重巢式RT—PCR结合寡聚核苷酸芯片方法,可快速并同时筛选出8种染色体结构畸变产生的融合基因,为儿童白血病危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据。此种方法应用于筛查初治白血病儿童融合基因表达时优缺点并存,具有一定临床实用价值。     

半巢式聚合酶链反应方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl-2/IgH基因重排

目的寻找一种敏感、特异的方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）bcl-2／IgH基因重排，并通过测定产物的序列，以了解所建方法的可靠性、方法运用专业引物设计软件设计bcl-2／IgH基因重排半巢式PCR引物，对52例经临床病理确诊的DLBCL石蜡包埋组织及10例慢性扁桃体炎患者的新鲜扁桃体组织通过半巢式递降温度梯度PCR（touch down PCR）扩增，检测bcl-2／IgH基因重排，并对其产物进行克隆和序列分析。结果 通过一步法检测到bcl-2／IgH基因重排8例，其中DLBCL6例，新鲜扁桃体组织2例；进行第2次半巢式PCR时仅在DLBCL中发现5例阳性，新鲜扁桃体组织均阴性。将阳性产物在网上序列分析显示：一步法检测到的8例中有3例为假阳性，而半巢式PCR扩增出的5例均为bcl-2／IgH基因重排片段。3例假阳性的片段分别与人类第19号染色体BAC331191，LLNLR-245D11基因片段及1号染色体RP11-498P10基因片段同源。结论常用的检测bcl-2／IgH基因重排引物扩增结果存在一定假阳性，其机制可能是因为人类基因组中存在与常用引物同源性较高的序列。为研究设计的引物与传统的引物结合，进行半巢式PCR可以排除这种假阳性扩增，提高诊断的准确性。     

应用半巢式PCR检测滤泡性淋巴瘤患者骨髓与外周血bcl-2／JH基因重排的临床意义

为探讨非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）患者骨髓与外周血ｂｃｌ－２／ＪＨ基因重排的临床意义，应用半巢式多聚酶链反应（ＰＣＲ）检测１０例滤泡性淋巴瘤（ＦＬ）患者骨髓与外周血标本ｂｃｌ－２／ＪＨ基因重排。结果检出６例存在ｂｃｌ－２／ＪＨ融合基因。骨髓细胞形态学检查发现的２例淋巴瘤细胞浸润者均检出该融合基因，另８例骨髓细胞形态学检查正常者中４例ＰＣＲ检查阳性，其中临床分期为Ⅱ期者１例，Ⅲ期者１例。因此，检测ＦＬ患者ｂｃｌ－２／ＪＨ融合基因能够早期发现骨髓淋巴瘤细胞侵犯，对临床分期、预后及微小残留病灶检测都非常重要。动态观察３例发病初期ＰＣＲ阳性患者，发现化疗后即使骨髓细胞形态学检查转为正常，但仍能检出该融合基因，提示常规化疗不能消除ｂｃｌ－２／ＪＨ阳性克隆。     

携带AML1/ETO+融合基因儿童急性髓细胞白血病患者骨髓细胞形态学特点

目的探讨携带急性髓细胞白血病1／821（acute myeloid leukemia 1／eighttwenty-one。AMLl／ETO）融合基因的儿童急性髓细胞白血病（AML）的形态学特点。方法对46例经多重逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测AML1／ETO融合基因阳性的儿童AML骨髓片用瑞特染液或与姬姆萨染液一起染色后，按照国内AML分型标准进行观察分析，同时，对免疫分型及细胞化学染色结果也进行了回顾分析。结果46例AML1／ETO融合基因阳性患儿中M2a、M2b、M4EO、M4、M5b分别占67．2％、19．6％、2．2％、6．6％、4．4％，其中M2b的构成比显著低于文献报道。免疫分型、细胞化学结果均支持形态学分型。结论儿童AML患者AML1／ETO融合基因阳性不能提示形态学是否可诊断为M2b；AMLl／ETO融合基因对儿童M2b没有成人特异。     

非霍奇金淋巴瘤患者骨髓单个核细胞BCL-2/IgH、IgH基因重排的检测

本研究检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者BCL-2/IgH基因主要断裂区重排、IgH基因重排,并探讨其对疾病的早期诊断、疗效评价等方面的意义。分别提取70例NHL(60例B-NHL、10例T-NHL)、7例淋巴结炎性肿大患者、20名正常人的骨髓单个核细胞DNA,通过PCR方法检测BCL-2/IgH、IgH基因重排,以凝胶电泳出现相应条带者为阳性,并与患者病理组织学检查进行比较,探讨此两种基因重排发生的相关因素,比较化疗后的动态变化。结果表明,①30例弥漫大B细胞淋巴瘤患者(DLBCL)中,10例骨髓BCL-2/IgH重排阳性(33.3%),与30例其它B-NHL(除外滤泡淋巴瘤FL及DLBCL)阳性率(6.7%)、20名正常人阳性率(5%)比较均有显著性差异(p均<0.05)。所有T-NHL及7例淋巴结炎性肿大患者BCL-2/IgH重排均为阴性;②对8例BCL-2/IgH基因重排阳性患者进行动态监测,经2个疗程R-CHOP治疗后BCL-2/IgH基因重排明显减少,PCR半定量结果均值由初治0.59降至0.16(p<0.05),6个疗程R-CHOP治疗后PCR半定量均值为0,BCL-2/IgH基因重排完全转阴;③BCL-2/IgH基因重排阳性患者中LDH水平升高占81.8%,在重排阴性患者中占28.6%,两组间有统计学差异(p<0.05)。然而,BCL-2/IgH基因重排与淋巴瘤分期、是否伴有全身症状、β2-MG水平、骨髓侵犯、肝脏脾脏侵犯均无显著相关性;④20例DLBCL(均为初治)骨髓单个核细胞DNA检测显示,9例IgH基因重排阳性(45%);30例其它B-NHL(均为初治或复发患者,DLBCL除外)中14例IgH基因重排阳性(46.7%),其两组间无统计学差异性(p>0.05),但对照组20名正常人、10例T细胞淋巴瘤患者及7例淋巴结炎性肿大患者均为阴性;⑤对7例IgH基因重排阳性患者进行动态监测表明,1个疗程的R-CHOP治疗就能显著减少IgH基因重排,PCR半定量结果均值由初治0.42降至0.13(p<0.05),2个疗程后PCR半定量均值为0,重排完全消除;⑥IgH基因重排阳性患者中LDH水平升高占90%,在重排阴性患者中占30%,两组间有统计学差异(p<0.05);IgH基因重排与淋巴瘤分期、是否伴有全身症状、β2-MG水平、骨髓侵犯、肝脏脾脏侵犯均无显著相关性。结论:BCL-2/IgH、IgH基因重排均可作为B-NHL早期诊断及评价疗效的特异性指标,这两种重排均与LDH水平相关;BCL-2/IgH基因重排对DLBCL特异性较高。     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。     

荧光原位杂交技术在套细胞淋巴瘤石蜡切片的应用研究

目的建立淋巴瘤石蜡切片应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测的操作流程,探讨其在套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)诊断中的应用价值。方法优化石蜡切片FISH检测步骤和实验条件,在16例病理拟诊断MCL的石蜡切片上应用FISH检测IGH/CCND1融合基因。结果确立了本实验室石蜡切片FISH检测的实验方法和条件;拟诊断MCL的病例中IGH/CCND1融合基因阳性检出率为75%(12/16)。结论淋巴瘤石蜡切片FISH检测可满足临床应用要求;应用FISH技术检测IGH/CCND1融合基因有助于MCL的诊断。     

实时定量PCR法检测淋巴瘤患者Bcl-2／IgH融合基因及其临床意义

本研究目的是检测滤泡性淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤患者bcl-2／IgH融合基因的表达水平,以探讨其临床意义。以SYBRGreenI荧光染料实时定量PCR方法检测20例患者外周血和（或）骨髓bcl-2／IgH融合基因的表达水平,并对其中4例患者bcl。2／IgH融合基因的表达水平进行动态监测。结果表明,在bcl-2／IgH融合基因阳性表达的病例中,骨髓和外周血bcl-2／IgH融合基因的相对拷贝数分别为4．23和2．73,统计学分析差异无显著性（P=0．107）,而治疗前后融合基因的相对拷贝数均数分别为3．61和2．69,统计学分析差异有显著性（P=0．000）,初诊及复发组的bcl-2／IgH融合基因表达水平明显高于缓解组（P=0．008）,在4例患者的外周血bcl-2／IgH融合基因动态监测结果中,l例患者在临床复发前3个月bcl-2／IgH融合基因表达水平明显上升。结论：bcl-2／IgH融合基因表达水平与患者的疾病状态有一定的相关性,初诊及复发患者融合基因的表达水平高,而缓解患者融合基因的表达水平低,治疗后融合基因表达水平较治疗前明显下降,bcl／IgH融合基因表达水平的变化可能与临床疾病进程有关,检测外周血是比较可行的。     

荧光原位杂交技术在慢性淋巴细胞白血病检测中的应用评估

本研究探讨与评估应用间期荧光原位杂交技术(FISH)检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)遗传学异常的价值。应用间期FISH技术检测32例初诊CLL患者的del(13q14.3)、del(11q22.3)、del(17p13.1)、del(13q14)和12号染色体三体,同时对免疫表型不典型的10例初诊患者检测IGH/CCND1融合基因。结果表明,在32例病例组中FISH检测出26例(81.3%)基因异常,包括D13S25缺失14例,RB1缺失11例,12号染色体三体9例,P53缺失6例,ATM缺失4例;涉及1种基因异常的12例,其中12号染色体三体7例,D13S25缺失3例,P53缺失1例,ATM缺失1例;涉及2种基因异常的11例,其中D13S25/RB1缺失的7例,另4例均包含P53缺失;涉及3种以上基因异常的病例3例;10例免疫表型表达CD5+CD23-的初诊患者中2例IGH/CCND1(+)。结论:应用间期FISH技术检测CLL基因组的异常,可大大提高异常染色体的检出率,各基因异常有其不同的特点;IGH/CCND1融合基因的检测在CLL诊断中有重要意义。     

BCL11A基因对γ-珠蛋白基因转录的影响

本研究旨在探讨B细胞淋巴瘤/白血病11A（B-cell lymphoma/leukemia 11A,BCL11A）基因对γ-珠蛋白基因转录的影响。通过小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术沉默人红白血病细胞（K562细胞）的BCL11A基因的表达,用实时荧光定量RT-PCR法定量细胞内γ-珠蛋白基因mRNA水平,分析BCL11A基因对γ-珠蛋白基因转录的调控作用。结果表明,所构建的4个siRNA表达载体对BCL11A基因表达的沉默率分别为49.7%、55.4%、78.2%和84.1%。将沉默率为84.1%的siRNA表达载体转导K562细胞,K562细胞的γ-珠蛋白基因的转录水平较转导对照载体质粒升高了2.4倍。结论：BCL11A基因表达被沉默后γ-珠蛋白基因mRNA水平升高显示BCL11A基因对γ-珠蛋白基因表达可能存在负调控。     

15例成人Ph染色体和/或BCR-ABL阳性混合表型急性白血病的临床及实验室特征分析

本研究总结成人Ph染色体和/或BCR-ABL融合基因阳性的混合表型急性白血病（Ph＋ MPAL）患者的临床和实验室特征.回顾性分析2009年1月-2012年9月在我院诊治的15例Ph＋ MPAL的特征及细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学检测以及临床随访结果.Ph＋ MPAL的诊断采用WHO-2008分类标准.结果表明,ph＋在同时期总MPAL群体中的检出率为17.2％（15/87）.15例患者中男性7例、女性8例;中位年龄为51（16-81）岁;初诊时中位WBC计数为69（12.7-921）×109/L.形态学检查显示为急性髓系白血病（AML）者2例（13.3％）,急性淋巴细胞白血病（ALL）者6例（40.0％）、杂合型白血病（HAL）者7例（46.7％）.免疫学分析表明,此15例患者均为B淋系和髓系混合表达,93.3％患者的白血病细胞表面有CD34的表达,其中64.3％（9/14）的患者CD34表达率在60％以上.染色体R显带技术检测显示,正常核型者2例（13.3％）,单纯Ph＋者8例（53.3％）,Ph＋伴附加异常者5例（33.3％）.附加的染色体异常分别为-7（2例）、＋Ph（1例）、dic（7;9）（1例）、i（8q）和-16（1例）;有残余正常分裂相者4例.多重巢式PCR检测发现,e1a2型融合基因6例（40.0％）、b2a2或b3a2型共9例（60.0％）.7例Ph＋ MPAL患者中有4例检测到IKZF1基因缺失.本组中10例患者诱导治疗一疗程后完全缓解（CR）率为70.0％,其中联合酪氨酸激酶抑制剂（TKI）组的CR率（83.3％;5/6）,优于单纯化疗组（50.0％;2/4）,但差异无统计学意义（P＞0.05）.随访至今,6例患者由于疾病复发或进展而死亡（60.0％;6/10）.异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）组患者总生存优于单纯化疗组（P =0.004）.结论：Ph＋ MPAL主要为B淋系和髓系混合表达,多数年龄较大,高表达CD34抗原.在BCR-ABL融合基因亚型和基因突变方面类似于Ph＋急性白血病.初诊时WBC计数是独立的预后因素,复发进展仍是此类患者死亡的主要原因.联合TKI和allo-HSCT或许能改善预后,有必要进行前瞻性、多中心的临床试验来验证.     

运用BIOMED-2 PCR检测脑脊液中的恶性B淋巴细胞

本研究旨在建立一种检测弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLB CL）中枢神经系统（CNS）累及患者脑脊液（CSF）中恶性B淋巴细胞的敏感的方法.对9例考虑有CNS累及风险的DLBCL患者采集其CSF,离心获取细胞沉淀,在直接裂解后运用BIOMED-2 PCR检测免疫球蛋白重链（IgH）基因重排（恶性B淋巴细胞特征性改变）,并将此方法的敏感性与细胞学检测及流式细胞术进行比较.此外,通过一系列数量/浓度的肿瘤细胞,分析两种样品处理方式（细胞直接裂解法和传统DNA提取法）导致的敏感度差异,并评估直接裂解法联合BIOMED-2 PCR方案的敏感度.结果显示,BIOMED-2 PCR检测到5例DLBCL患者的CSF中存在克隆性IgH基因重排（恶性B淋巴细胞“阳性”）,而细胞学检测和流式细胞术均只能明确检测2例为“阳性”,表明BIOMED-2 PCR敏感性高于细胞学检测和流式细胞术.另外,经过改进的样品处理方式——细胞直接裂解法比传统的DNA提取能获得更高的BIOMED-2PCR敏感度,前者可以检测到浓度低至1％、细胞数低至20个的肿瘤细胞.结论：细胞直接裂解联合BIOMED-2PCR是一种敏感的、非常适用于CSF（细胞数少）的检测方法,可辅助诊断DLBCL病例的CNS累及.     

TRAF6,TAK1和TGF-β基因在弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗前后外周血单个核细胞中的表达

本研究检测弥漫大B细胞性淋巴瘤（DLBCL）患者外周血单个核细胞中TRAF6、TAK1及TGF-β基因在化疗前后的表达变化,探讨化疗对TRAF6/TAK1信号通路活性的影响.采用Ct值比较法,通过SYBR Green Ⅱ实时定量PCR检测38例DLBCL患者化疗前及化疗2周期后外周血单个核细胞（PBMNC）中TRAF6、TAK1及TGF-β在mRNA的表达水平,并以12例健康人PBMNC作为对照.结果表明：DLBCL患者治疗前后PBMNC中TRAF6、TAK1和TGF-β mRNA表达水平均高于正常人.治疗前患者TRAF6及TAK1基因表达水平与正常人相比未发现统计学差异（P＞0.05）,治疗后这两基因的表达明显增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在此同时治疗后与治疗前相比,这两基因的表达水平也具明显统计学差异（P＜0.05）,且这两基因的表达水平呈明显正相关,而TGF-β基因治疗后较治疗前明显下降,差异具统计学差异（P＜0.05）.结论：DLBCL患者化疗后TRAF6/TAK1信号通路的活性明显增高,而TGF-β基因治疗后则较治疗前明显下降.     

SET-NUP214融合基因在急性T淋巴细胞白血病患者中的表达及临床意义

本研究旨在探讨SET-NUP214融合基因在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中的表达,分析伴有SET-NUP214的T-ALL的临床及分子生物学特征。运用RT-PCR检测58例T-ALL患者骨髓标本中SET-NUP214的表达,以间期荧光原位杂交(FISH)及微阵列比较基因组杂交(Array-CGH)检测9q34缺失,基因测序法检测PHF6和NOTCH1基因突变。结果表明,仅在6例T-ALL患者中检测到SET-NUP214融合基因的表达。除T系抗原标记外,这些患者均表达髓系抗原CD13和(或)CD33,其中4例患者经FISH检测到9q34缺失,3例患者经Array-CGH检测到del(9)(q34.11q34.33)。6例SET-NUP214阳性的T-ALL患者中有4例检测到PHF6基因突变,5例检测到NOTCH1基因突变。结论:SET-NUP214融合基因多由染色体9q34的缺失所致,SET-NUP214阳性的T-ALL常伴有PHF6及NOTCH1基因突变。