表达屋尘螨Ⅰ类变应原Der p 1的基因工程菌的发酵条件探讨

目的 探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组屋尘螨Ⅰ类变应原(Der p 1)的影响.方法 应用摇瓶发酵试验观察不同诱导时间和不同诱导时机对Der p 1表达量的影响.结果 (1)Der p 1基因在E.coli BL21(pBVDP8)菌密度A600 nm0.6左右时,42℃最佳诱导时间为4 h.(2)工程菌E.coli BL21(pBVDP8)在30℃培养至A600 nm为0.5～0.7时,42℃诱导4 h Der p 1表达量最高.结论 确定了最适诱导时间和诱导时机,初步形成了一套高表达Der p 1的发酵技术.     

影响人γ—型干扰素基因在工程菌中表达效率的因素研究

本工作研究了影响人γ—型干扰素基因在工程菌中表达效率的3种因素；结果表明：采用M9＋LB发酵培养基，控制工程菌培养时间和温度，即种子菌在LB（Amp）液中30℃生长10h，转入发酵培养基中30℃扩增3h，42℃诱导培养3h，并按种子菌液与发酵培养液2％的比例扩增工程菌，可使发酵菌液中工程菌密度达OD（600）1．6，IFN－γ表达水平占菌体总蛋白的65％～70％，使IFN－γ活性达1．68×107IU／ml。     

诱导重组人生长激素工程菌高效表达的研究

目的 筛选诱导重组人生长激素（rhGH)工程菌高效表达的最佳条件，为中试及工业化发酵培养提供依据。方法 质粒PBV－GH转化4种不同宿主菌，比较6种不同培养基在不同pH值、氧含量改变情况下，rhGH工程菌的生长和表达差异，筛选并确定最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件。结果 ①E.coli DH5α为最适宿主菌；②TB培养基为最佳培养基；③培养基pH7.5-7.8有利于目的蛋白的表达。④在半对数生长期（培养4－5h)迅速升温，且菌密度控制在D600nm3.0之前诱导可获得较高的重组蛋白表达量，rhGH表达量占菌体总蛋白的40％。发酵时间为10h。结论 E.coli DH5α为rhGH高效表达的最适工程菌，E.coli DH5α/PBV-GH在pH7.5-7.8的TB培养基中发酵生长10h，可使菌量最佳扩增，目的产物rhGH表达效率最高。     

人血管抑素基因工程菌发酵条件的初步研究

目的：探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素（ｒｈＡＧＮ）的影响。方法：应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及ｐＨ、通气量等对ｒｈＡＧＮ表达量的影响。结果：（１）工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＢＶＡ２）在３０℃培养至Ａ６００ｎｍ为０．３～０．５时于４２℃诱导４ｈｒｈＡＧＮ表达量最高,约为２１２ｍｇ／Ｌ;（２）１５Ｌ发酵罐发酵参数为ｐＨ７．２,搅拌转速５００ｒ／ｍｉｎ,通气     

重组人骨形态发生蛋白—2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2)，方法：hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化E.coli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析DEAE和分子筛S－300纯化重组蛋白，自然缓降复性法对其复性。结果：SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带，而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时，其表达效率较高，在此状态下，温度诱导表达4h，目的蛋白表达量最高，以后随着时间的延长，表达量销下降，重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉，组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成，结论：重组hBMP-2具有良好异位成骨活性。     

用重组大肠杆菌生产rhG-CSF高密度发酵的方法

目的 :优化重组人粒细胞集落刺激因子 (recombinanthumangranulocytecolony stimulatingfactor,rhG CSF)的生产工艺 ,了解菌体生长和产物合成规律 ,为rhG CSF的工业化生产提供依据 .方法 :以摇瓶发酵的研究结果为基础 ,在 5L发酵罐中 ,测定工程菌rhG CSF的生长曲线 ,根据在不同pH值、溶氧和诱导时机时工程菌生长的情况 ,研究重组大肠杆菌DH5(/pBV2 2 0生产rhG CSF分批补料培养的工艺条件 ,确定 5L发酵罐稳定的发酵工艺参数 .结果 :培养工程菌的优化条件为 :发酵前期流加 2mol/L的氢氧化钠控制pH值为 7.2 ,当开始诱导表达时 ,控制pH为 6 .8;溶氧水平控制在 5 0 %以上 ;选择菌体在对数生长中期A60 0nm值为 1 2 .0进行诱导表达 .在此优化的培养条件下 ,菌体A60 0nm值达到 (2 1 .3± 0 .9) ,细胞干质量可达 (1 2 .3± 0 .7)g/L ,细胞湿体积质量为 (4 3.8± 0 .9)g/L ,rhG CSF的表达量为 (4 1 .9± 1 .6 ) % .结论 :pH值、溶氧和诱导时机等培养条件对工程菌生长和表达有显著影响     

重组流行性乙型脑炎病毒E基因原核表达条件的优化

目的：对重组流行性乙型脑炎病毒E基因0EVE）进行优化表达研究。方法：采用正交实验设计L9（34）方案,通过SDS—PAGE分析,对诱导时机、诱导时间、IPTG浓度、诱导温度四因素对重组产物表达的影响进行了研究。结果：菌体在37℃培养条件下,当LB培养基OD600达到0．8时,加入终浓度为0．025mmol／L的异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（1sopropylthio—β—D—galactoside,IPTG）诱导4h,可获得较高表达量的重组乙脑病毒E蛋白。结论：获得较为满意的表达条件,为下步纯化和进一步大规模生产奠定了基础。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pn、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃．最佳抗生素浓度为50μg／mL羧苄青霉素．最适pH值为7．0,在A600为0．9～1．0时加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg／L．产量较优化前（15mg／L）提高近30％：mK5特异性地抑制HRCEC的增殖．IC50=40nmol／L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数．并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

导向性人干扰素α2a工程菌的高密度发酵

目的:优化大肠杆菌表达导向性人干扰素α2a的中试发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达. 方法:采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件,如pH值、活化时间、诱导时间、溶氧范围及补料流加方式等进行优化. 结果:根据优化条件,连续三批重复发酵10 L工程菌,最终菌体密度均达A600 nm 25～30,菌体获得量均可达湿重50 g/L以上,目的蛋白表达量均为3.2×109 U/L以上. 结论:此发酵工艺具有周期短、产量高以及重复性稳定性好的特点,为下游纯化和进一步大规模生产奠定基础.     

IL-2基因工程菌生长密度对rhIL-2表达的影响

目的：观察不同培养时间和细菌密度对重组人白细胞介素－２（ｒｈＩＬ－２）基因工程菌的收获量和ｒｈＩＬ－２表达量的影响。方法：用４０Ｌ发酵罐进行了３批发酵试验。结果：工程菌于３０℃培养４．５～５ｈ,细菌生长密度（ＯＤ６００）在１．７～２．０之间。在此条件下,工程菌再经４２℃诱导培养４ｈ,菌体的收获量和表达水平都比较理想,其湿重和表达量的均值分别可达６．３ｇ／Ｌ（菌液）和３１．６％。结果：诱导前不同培养     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白基因工程菌的发酵条件研究

目的研究呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）G蛋白基因工程菌的发酵工艺。方法通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件和表达条件，以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件，对发酵丁艺进行改良优化。结果确定了RSVG蛋白基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合：在LB＋葡萄糖的培养基中，搅拌速度为200r／min，培养温度为37℃，pH值为7．0，诱导时温度为25℃，IPTG浓度为0．01mmol／L，优化后T程菌菌体的产量可以达到39．20g／L，目的蛋白表达率平均为18．1％。结论建立了稳定高效的重组RSVGT程菌发酵工艺。     

重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)。方法hBMP－2原核表达载体pYR(pBV220－hBMP-2)转化 E coli BL21,SDS－PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析 DEAE和分子筛 S－300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性。结果SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导衣达4h,目的蛋白表达量最高,以后随着时间的延长,表达量稍下降。重组蛋白经纯化后植人小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间允质细胞增生以及软骨与骨形成。结论重组hBMP－2具有良好异位成骨活性。     

利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组肿瘤导向多肽LTL-TNF

目的　探讨重组肿瘤导向多肽 L TL - TNF工程菌的大规模培养与表达方法以获取重组 L TL TNF.方法　首先在试管和三角瓶中探讨工程菌的生长和表达规律 ,筛选其最适宿主菌、最佳培养及诱导表达条件 ,然后在 5 L 自控发酵罐中进行分批补料培养 .结果　保持培养过程中 30 %～ 40 %的溶解氧和限制性流加葡萄糖 ,工程菌 DH5 α/ p BV- L TL TNF在5 L 发酵罐中培养至终密度 A6 0 0 nm 40～ 5 0时 ,目的蛋白的表达最高 ,可达菌体总蛋白的 5 0 % ,L TL - TNF的含量达到5 .12 g· L- 1 ,发酵总时间在 12 h左右 .结论　确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为重组肿瘤导向多肽L TL TNF工程菌的工业化生产奠定了基础 .     

谷胱甘肽合成酶系基因协调表达体系的构建

通过 PCR获得 E.coli B谷胱甘肽合成酶系基因 ( gsh I,gsh II)片段 ,结合定点突变稀有起始密码子 ,设定 gsh I与 gsh II位置与距离 ,构建双顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I- gsh II,建立GSHI、GSH- II蛋白表达体系。结果表明 :以 0 .0 8mmol/L IPTG于 2 8℃诱导工程菌 E.coli BL2 1( DE3) ( p Trc99A/gsh I- gsh II) ,GSH- I、GSH- II蛋白比为 4.5∶ 1 ( m∶ m)时谷胱甘肽合成能力最高 ,达到每克湿菌体 8.5 mg。通过构建单顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I、p Trc99A/gsh II测定GSH- I与 GSH- II蛋白的最适配比 ,结果表明 :在 GSH- I、GSH- II蛋白总量恒定的情况下 ,要提高谷胱甘肽产率 ,两者比例以 3∶ 1～ 6∶ 1为宜     

分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素A基因工程菌的发酵研究

目的：优化重组铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因工程菌的发酵条件，实现PEA的高效表达。方法：构建PEA的原核分泌型基因工程菌，利用摇瓶发酵研究PEA工程菌的最优表达条件，并放大至3．75L发酵罐水平。结果：摇瓶发酵的最优培养条件为温度30℃，摇床转速160r／min，在含2g／L葡萄糖的LB培养液中培养至A600≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的异丙基硫基半乳糖(IPTG)诱导表达5h。3．75L发酵罐发酵与摇瓶发酵相比，发酵周期缩短了约三分之一，PEA表达水平接近摇瓶中发酵水平，目标蛋白表达率达到了26．6％。结论：利用摇瓶最优表达条件，较好地实现了重组PEA从摇瓶到发酵罐的放大。     

β淀粉样蛋白诱导大鼠小胶质细胞脂多糖受体CD14和肿瘤坏死因子-αmRNA的表达

目的：研究不同浓度的p淀粉样蛋白（Aβ1-42）诱导大鼠小胶质细胞脂多糖受体CD14和肿瘤坏死因子-αLmRNA表达的变化。方法：小胶质细胞株复苏培养后分为2组：Aβ1-42组和抗CD14加Aβ1-42组。抗CD14加Aβ1-42组使用抗CD14抗体拮抗CD14的表达，再分别用不同浓度的Aβ1-42（0、62．5nmol／L、125nmol／L、250nmol／L）进行干预，2组均在Aβ1-42干预2h后用RT—PCR法检测CD14及TNF—αmRNA表达的量。结果：不同浓度的Aβ1-42干预小胶质细胞2h后，62．5nmol／L与0nmol／L Aβ1-42组CD14mRNA的表达相比较，差异无统计学意义。当Aβ1-42浓度为125nmol／L和250nmol／L时，CD14mRNA的表达逐渐增加（P〈0．05）。使用CD14抗体后，抗CD14加Aβ1-42组中CD14mRNA的表达与Aβ1-42组比降低（P〈0．05）。Aβ1-42组TNF-αmRNA的表达随Aβ1-42的浓度增加而增加（P〈0．05），与Aβ1-42组相比，抗CD14加Aβ1-42组中TNF-αmRNA的表达在Aβ1-42浓度为125nmol／L开始明显受到抑制（P〈0．05）。结论：Aβ1-42诱导的小胶质细胞可通过脂多糖受体CD14使TNF-αmRNA的表达增加，且与Aβ1-42的作用浓度呈正相关。     

依曲替酸诱导上皮鳞癌细胞凋亡及相关信号途径的改变

目的：研究依曲替酸诱导上皮鳞癌细胞凋亡及其分子机制。方法：用MTT法观察依曲替酸对A431细胞的生长影响，电镜观察细胞形态，流式细胞仪检测凋亡峰的出现，Annexin-V染色证实凋亡的发生。同时用逆转录PCR法观察，经依曲替酸作用不同的时间后，A431细胞中信号传导和转录激活因子3（STAT3）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p42／44丝裂原激活的蛋白激酶（p42／44MAPK）mRNA表达的改变；用蛋白印迹术，研究经依曲替酸作用不同的时间对A431细胞中磷酸化STAT3（p-STAT3）、CyclinD1蛋白表达的影响。结果：①随着依曲替酸作用时间的延长及剂量的增加，对A431细胞增殖的抑制作用增加。流式细胞仪检测显示，亚G1期凋亡峰明显增加，电镜观察和Annexin-V染色证实了凋亡的存在。②依曲替酸能明显抑制A431细胞中STAT3、CyclinD1 mRNA表达的改变，随着作用时间的延长，抑制作用增强，P〈0．05；并下调p-STAT3、CyclinD1蛋白的表达；下调p42／44MAPK mRNA的表达。③经依曲替酸作用后，A431细胞中CyclinD1 mRNA表达的下降与STAT3 mRNA表达的下降呈正相关，P〈0．05；p-STAT3、CyclinD1蛋白也同步下调，P〈0．05；而CyclinD1 mRNA表达的下降与p42／44MAPK mRNA的下调无相关性。结论：①依曲替酸具有抗上皮鳞癌细胞生长及诱导上皮鳞癌细胞凋亡作用。②依曲替酸抗上皮鳞癌细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的机制，可能主要是通过调节JAK／STAT3信号途径而实现的。     

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的：研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB－UreB)融合基因工程菌BL21的发酵工艺，方法：采用德国B.Brau公司C－10型15L发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化，结果：在优化的条件下，15L发酵罐发酵工程菌，菌体收获量可达52．2g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的27％，结论：此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。     

溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.