趋化因子Fractalkine在急性肝功能衰竭大鼠模型中的变化及意义

目的 探讨不规则趋化因子Fraetalkine(FKN,CX3CLl)在急性肝功能衰竭大鼠模型中的变化及其在肝脏炎性损伤中的作用.方法 SD大鼠分为健康对照组6只,模型组36只.D氨基半乳糖(D-Gal)诱导大鼠急性肝功能衰竭模型,造模后分别在12、24、48、72、120和168 h等6个时间点取大鼠血及肝脏标本,RT-PCR法检测肝组织中FKN mRNA、核因子(NF)-kB mRNA的变化.计量资料组间比较用t检验,相关性检验用Pearson直线相关分析.结果 造模后12 h,大鼠血ALT、AST值明显升高,分别为(208.3±43.5)U/L和(375.25:117.3)U/L,显著高于正常组的(31.8±2.9)U/L和(90.8±3.1)U/L,差异有统计学意义(t值分别为-9.912和-5.935,P＜0.01),72 h达高峰.造模后12 h,FKN mRNA为0.086±0.009,高于正常组的0.044±0.009,差异有统计学意义(t=-7.999,P＜0.01),72 h达高峰,为0.333±0.033,120 h则明显下降.NF-kB在正常大鼠肝组织中有少量表达,模型组随着时间推移,NF-kB水平逐渐升高,72 h达高峰,为0.583±0.101(t=-12.607,P＜0.01).FKN与NF-kB呈正相关(r=0.760,P＜0.01).结论 FKN在急性肝功能衰竭大鼠中的表达是肝损伤的重要因素,有可能为急性肝功能衰竭的治疗提供一个新的切入点.     

乌司他丁对急性肝功能衰竭大鼠肝组织中血红素加氧酶-1 mRNA和蛋白表达的影响

目的 探讨乌司他丁对急性肝功能衰竭的保护作用及对血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)的影响.方法 66只S-D大鼠分为对照组、模型组和乌司他丁干预组,通过腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal)及脂多糖(LPS)建立大鼠急性肝功能衰竭模型,动态观察(6、12、24、36和48 h)大鼠血清ALT、AST和丙二醛(MDA)含量变化,RT-PCR检测肝脏HO- mRNA变化,免疫组织化学方法检测HO-1蛋白表达.多组间差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法.结果 D-Gal/LPS联合注射成功诱导大鼠急性肝功能衰竭模型,表现为造模6 h后血清ALT、AST水平以及肝组织MDA浓度均显著升高(F值分别为23.864、38.446、18.051,均P＜0.01),以12至24 h之间最为显著.造模24 h后,模型组与干预组ALT、AST、MDA分别达到(8 346.7±1 363.1)U/L、(9 766.7±1 274.1)U/L、(8.34±1.13)μmol/g与(4 151.3±970.0)U/L、(4 696.7±1 476.9)U/L、(4.66±0.91)μmol/g,均较对照组的(24.0±2.0)U/L、(82.3±16.9)U/L、(2.55±0.22)μmol/g高(F值分别为55.684、55.501、47.843,均P＜0.01),但干预组显著低于模型组(P＜0.01);与对照组相比,模型组HO-1 mRNA及其蛋白表达增加(P＜0.01),干预组的上升更加显著(P＜0.01).结论 乌司他丁能上调HO-1 mRNA和蛋白表达,提示乌司他丁可能通过HO-1通路发挥其在急性肝功能衰竭中抗炎抗氧化的保护作用.     

肝功能衰竭模型的研究进展

肝功能衰竭(hepatic failure,HF)在临床研究中,因为病情复杂、影响因素多、缺乏对照,往往难以确切的判断疗效.建立理想的HF模型,是进行研究的基础.     

D-氨基半乳糖诱导的猪急性肝功能衰竭模型的建立与改进

目的 建立和改进D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的猪急性肝功能衰竭模型,探讨其应用于人工肝临床前评价的可行性.方法 19只杜洛克种猪分成4组,其中15只(每组5只)在无麻醉条件下通过颈静脉置管分别注射1.0、1.25及1.5 g/kg的D-gal,其余4只注射等量的5%葡萄糖液作为对照组.记录动物临床表现和存活时间,动态检测血氨、PT、肝肾功能、血糖、L-乳酸等指标和肝组织学变化.采用t检验及F检验比较上述指标的组间差异,采用Kaplan-Meier生存分析及LogRank检验比较动物存活时间.结果 注射D-gal 12 h后,所有动物出现明显的肝损伤表现,表现为血氨、AST、TBil及L-乳酸水平进行性升高,血糖水平显著下降,PT逐渐延长,与对照组比较,差异有统计学意义(F=32.33,F=27.817,F=50.097,F=88.382,F=8.211,F=21.227;均P＜0.01),尤以注射1.5 g/kg D-gal组的变化为著.接受1.0 g/kg D-gal的动物除2只存活超过168 h外,其余3只于68～84 h内死亡,而接受1.25 g/kg和1.5 g/kg D-gal的动物分别于33～89 h和23～47 h内死亡,死前均出现昏迷,病理学检查提示肝组织大片坏死伴出血.结论 在无麻醉条件下D-gal诱导的杜洛克种猪急性肝功能衰竭模型均具有潜在的可逆性和良好的重复性,且具有合适的治疗时间窗口,适宜于人工肝疗效和安全性评价研究.     

解耦联蛋白2在急性肝功能衰竭大鼠肝脏中的动态表达和意义

目的 探讨急性肝功能衰竭(ALF)大鼠肝脏线粒体解耦联蛋白(UCP)2的表达趋势及意义.方法 健康雄性SD大鼠36只,分为对照组和模型组,模型组冉分为6、12、24、36和48 h 5个亚组,每组6只.模型组腹腔内注射D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)诱导大鼠ALF模型.采用HE染色,光学显微镜下观察肝组织损伤情况,采用RT-PCR和免疫组织化学检测不同时间点肝脏UCP2 mRNA转录及其蛋白表达,同时测定各时间点血清ALT、AST和肝组织丙二醛(MDA)的变化.各实验组问数值比较采用SNK检验.结果 模型组肝组织呈炎性细胞浸润和明显坏死的ALF特征;模型组ALT、AST、MDA值均明显高于对照组[(24.0±2.0)U/L,(82.3士16.9)U/L,(2.55±0.22)μmol/g],且造模24 h达高峰[(8346.7±1363.1)U/L,(9766.7±1274.1)U/L,(8.34±1.13)μmol/g;均P<0.05];UCP2蛋白和UCP2 mRNA在正常肝组织中几乎不表达,D-Gal和LPS处理后6 h表达均硅著增加(P<0.05),24 h表达最强,且模型组相邻时间点之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建大鼠ALF模型,大鼠ALF时UCP2蛋白和UCP2mRNA的表达水平与肝损伤程度及氧化应激水平有关.     

S期激酶相关蛋白2在急性肝功能衰竭大鼠肝组织中的表达

目的 探讨急性肝功能衰竭(ALF)大鼠S期激酶相关蛋白2(Skp2)表达变化及意义.方法 雄性SD大鼠256只,其中240只用D-氨基半乳糖溶液制备ALF模型.将大鼠分为ALF模型组、裸肝细胞移植组和微囊化肝细胞移植组,经腹腔分别注射RPMI 1640培养液、裸肝细胞悬液、微囊化肝细胞悬液各2 mL.另外6只作为健康对照组,另10只用于肝细胞分离.免疫组织化学法检测不同时间点大鼠肝细胞中Skp2蛋白的表达,全自动生化分析仪测定各组ALT、AST、TBil值,并观察各组生存率,多组样本间比较采用单因素方差分析.结果微囊化肝细胞腹腔移植可较裸肝细胞更好地降低ALF大鼠ALT、AST、TBil水平(P<0.05).造模36 h时,ALF模型组、裸肝细胞移植组和微囊化肝细胞移植组肝中Skp2-标记指数分别为(28.2±6.1)%、(41.4±10.5)%和(68.0±10.8)%(F=29.08,P<0.05),三组各15只大鼠168 h时各有4、6和11只存活.结论 动态观察Skp2表达可较好地判断ALF肝细胞的再生情况.     

大鼠慢加急性肝功能衰竭模型的制备

目的：探索建立大鼠慢加急性肝功能衰竭模型的方法。方法SD 大鼠40只,随机分为正常对照组、模型1组、模型2组和模型3组,每组各10只。模型1组：每周二、五腹膜内注射40％ CCl41 mL/kg;持续4周;模型2组：每周二、五腹膜内注射40％ CCl41 mL/kg,每周三腹膜内注射猪血清0．5 mL,持续4周;模型3组：每周二、五腹膜内注射40％CCl40．7 mL/kg,每周三腹膜内注射猪血清0．3 mL,持续4周,以5％乙醇代水,自由饮用;正常对照组：不注射任何药物。实验第29天,各模型组大鼠均腹膜内注射脂多糖（LPS）30μg/kg＋犇-氨基半乳糖（犇-Gal ）0．3 g/kg。以全自动生化分析仪检测大鼠血清 ALT、AST 和 TBil 水平。肝组织切片 HE 染色后光学显微镜镜下观察病理学变化。结果造模4周后各模型组大鼠血清 ALT、AST 和 TBil 水平均明显高于正常对照组（均P＜0．01）,以模型3组最高、模型2组其次,3组间差异均有统计学意义（均P＜0．01）。注射 LPS＋犇-Gal 后24 h,模型3组中有3只动物死亡,3个模型组大鼠的 ALT、AST和 TBil 水平均较注射前明显升高（均P＜0．01）,3组间差异均有统计学意义（均P＜0．01）。注射 LPS＋犇-Gal 后72 h,各模型组大鼠 ALT、AST 和 TBil 水平均较前明显降低（均P＜0．01）,但仍明显高于正常对照组（均P＜0．01）,3组间差异仍均有统计学意义（均P＜0．01）。注射 LPS＋犇-Gal 后24 h,肝窦明显扩张、充血,大量炎性细胞浸润于汇管区,小叶内见肝细胞坏死。结论采用40％ CCl4＋猪血清诱导慢性肝损伤后,再以 LPS 30μg/kg＋犇-Gal 0．3 g/kg 攻击,可成功制备大鼠慢加急性肝功能衰竭模型。     

D-半乳糖胺/脂多糖所致小鼠急性肝衰竭模型正交试验优化研究

目的 通过正交试验优化D-氨基半乳糖(D-GalN)和脂多糖(LPS)致急性肝衰竭模型,确定合理造模剂量,以期使造模更加符合研究需要.方法 选取3个可能影响造模成功率的指标为实验因素:D-GalN剂量、LPS剂量、稀释倍数,每个实验因素选取4个水平,利用L16 (45)正交表安排试验,以小鼠24 h病死率为考察指标.观察小鼠血清ALT、肝组织学改变,肝脏细胞凋亡情况以验证造模效果.结果 优化后理想造模给药方案为D-GalN 350 mg/kg联合LPS 30 μg/kg,混合后稀释3倍,腹腔注射.造模后6h可出现典型肝衰竭表现.结论 优化了D-GalN/LPS致小鼠ALF模型,使其更符合科研需要.     

黄芩苷对急性肝衰竭大鼠肝脏核转录因子-κB表达的影响

目的观察急性肝衰竭大鼠肝脏NF-κB的表达水平及黄芩苷对其表达的影响。方法雄性SD大鼠106只随机分为正常组、肝衰竭组和黄芩苷组。肝衰竭组和黄芩苷组采用腹腔注射D-氨基半乳糖制备大鼠急性肝衰竭模型;黄芩苷组于造模后每隔12 h以120 mg/kg剂量腹腔注射。造模后24 h、72 h、120 h和168 h处死大鼠。全自动生化仪检测血清ALT、AST和TBil水平;HE染色观察肝脏病理学变化;RT-PCR法检测肝组织NF-κB、TNFα、Caspase-3 mRNA表达;免疫组化法检测肝组织NF-κB蛋白表达。结果黄芩苷组大鼠168 h存活率明显高于肝衰竭组。黄芩苷组大鼠各时间点血清ALT、AST、TBil水平较肝衰竭组明显降低（F=173.584,158.329,74.902;P〈0.01）。黄芩苷组NF-κB、TNFα、Caspase-3 mRNA表达趋势与肝衰竭组相同,72 h达高峰,但表达量较肝衰竭组明显减少,差异有统计学意义（F=603.801,42.174,27.222,P〈0.001,P〈0.001,P=0.001）。黄芩苷组NF-κB蛋白的表达也于72 h达到最大值,但其表达量较肝衰竭组减少,其差异有统计学意义（F=8.903,P=0.017）。结论黄芩苷对D-氨基半乳糖诱发的大鼠急性肝衰竭有保护作用,其机制可能与黄芩苷下调NF-κB、TNFα和Caspase-3的表达有关。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠暴发性肝功能衰竭治疗作用的初步观察

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)移植对大鼠暴发性肝功能衰竭(FHF)的治疗作用.方法 全骨髓细胞贴壁培养筛选法分离纯化大鼠MSC;四氯化碳灌胃制作大鼠FHF模型,分为实验组和模型对照组,各20只,8只灌服等剂量0.9％氯化钠溶液作为空白对照组.将4 ’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记的大鼠MSC 1.0×106从尾静脉移植入实验组和空白对照组,等剂量0.9％氯化钠溶液尾静脉注入模型对照组;分别于术后7、14 d处死各组部分大鼠,评价实验组与模型对照组大鼠一般状况、生存率、肝功能、TNF-α水平、肝脏病理、MSC归巢至肝脏的情况.正态分布资料采用两个独立样本t检验,非正态分布资料采用非参数检验.结果 术后3d开始,实验组存活大鼠一般情况比模型对照组好转更加明显;术后7d,实验组与模型对照组各有15只和8只大鼠存活,差异有统计学意义(x2 =4.122,P＜0.05);术后7d以及14 d,实验组与模型对照组相比,肝功能指标、TNF-α水平均差异均有统计学意义(均P＜0.05),病理学检查肝组织炎性反应改善情况实验组均更为明显;术后实验组MSC归巢细胞逐渐增多,空白对照组只观察到很少量归巢细胞.结论 MSC经尾静脉同种异体移植,可以归巢到肝功能衰竭大鼠肝脏,改善大鼠免疫和肝脏组织炎性反应坏死状态,促进FHF大鼠肝功能的恢复,对FHF具有明显的治疗作用.     

D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导急性肝功能衰竭小鼠血清微小核糖核酸的表达

目的 探讨D氨基半乳糖联合脂多糖诱导急性肝功能衰竭小鼠血清微小核糖核酸(miRNA)的表达变化以及与肝组织miRNA的相关性.方法 Balb/C清洁级小鼠40只分为两组,模型组32只,对照组8只.模型组应用D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导Balb/C小鼠急性肝功能衰竭,对照组腹腔注射0.9％氯化钠溶液1 mL.模型组给药后0、3、5和7h分别处死小鼠各8只,采集血清及肝组织,观察小鼠给药后肝功能生物化学指标及肝组织病理学变化.抽提血清及肝组织miRNA,取0、5和7h肝组织进行锁核酸(LNA)-miRNA微阵列分析,并用实时定量反转录PCR检测miRNA.组间均数比较用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson和Spearman相关分析.结果 随着小鼠急性肝功能衰竭的发生,肝组织miRNA的表达发生显著变化,共有21个miRNA明显上调,27个miRNA明显下调,其中miRNA-122和miRNA-1187表达下调,miRNA-146a、miRNA-155表达上调.经PCR验证发现小鼠肝组织miRNA 122和miRNA-1187表达逐渐下调,血清miRNA-122和miRNA-1187的表达则逐渐上调;炎性相关的miRNA 146a和miRNA-155在肝组织和血清中表达均明显增加.小鼠miRNA-122和miRNA-1187在组织与血清中的表达呈负相关(r值分别=-0.477和-0.420,P值分别=0.0089和0.0231),而miRNA-155在组织与血清中表达呈正相关(r=0.678,P=0.0001).小鼠血清miRNA 122(r值分别=0.571和0.554)、miRNA-1187(r值分别=0.471和0.542)的相对表达量与ALT和AST水平均呈正相关(均P＜0.05).血清miRNA 122和miRNA-1187在给药5h上升显著,早于血清转氨酶的变化.结论急性肝功能衰竭小鼠肝组织和血清miRNA-122和miRNA-1187的表达呈负相关,血清中miRNA-122、miRNA-1187的变化早于血清转氨酶的变化,有可能成为早期预测肝损伤的血清标志物.     

小异质二聚体伴侣在大鼠肝纤维化中的动态表达及意义

目的 观察小异质二聚体伴侣(SHP)在大鼠肝纤维化进展过程中的动态表达变化及 其意义.方法 30只健康雄性SD大鼠分为对照组6只,模型组24只,模型组再按不同时间点分为2、4、6、8周4个亚组.二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型.造模后分别在不同时间点取大鼠门静脉血并留取肝脏标本,肝组织经HE和Masson染色后观察各组病理变化;RTPCR和Western印迹法检测SHP mRNA及蛋白在造模过程中的动态变化.各组间均数比较采用单因素方差分析.结果 模型组第4、6周肝纤维化明显,血清ALT、AST升高,4周时达高峰,分别为(169.2±16.2)、(193.3±31.1)U/L; Alb逐步下降,6周时最低;各时间点与对照组比较差异均有统计学意义(FAST=83.10,FALT=104.63,FAlb=54.24;均P＜0.05).造模后,SHP mRNA及蛋白在正常肝组织中都有少量表达,模型组表达显著增加,第4周达高峰,分别为0.4494±0.0555和1.1155±0.1546,第6、8周逐渐降低,且明显低于对照组;转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA表达水平逐步增高,于4周时达高峰,为0.9625±0.1196,各模型组与对照组相比,差异均有统计学意义(F=25.740、171.383、118.393、94.343,均P＜0.05).直线相关分析提示,SHP mRNA与TGFβ1mRNA呈正相关(r=0.593,P＜0.01).结论 SHP在肝纤维化进展过程中的表达呈先升高后下降的趋势,提示可能在肝纤维化发生发展过程中发挥重要作用.     

1977例急性、亚急性、慢加急性肝衰竭患者的病因与转归分析

目的 探讨急性肝衰竭(ALF)、亚急性肝衰竭(SALF)、慢加急性肝衰竭(ACLF)的病因. 方法回顾性总结1977例肝衰竭患者的临床资料,对病因、年龄、性别、转归等方面进行比较分析.结果 ALF的前三位病因是:HEV感染(33.96%)、HBV感染(13.21%)与药物性肝病(9.43%);SALF为药物性肝病(31.53%)、HEV感染(16.22%)、HBV感染(9.91%);ACLF为HBV感染(90.29%)、洒精性肝病(2.65%)、HBV与HEV重叠感染(2.26%).常见嗜肝病毒感染者占90.09%(1781例),其中单HBV感染占92.93%(1655例).在HBV感染者中(1655例),26～55岁患者占77.10%(1276例).2005-2007年酒精性肝衰竭患者39例,占酒精性病因患者的81.25%(48例);2006-2007年药物性肝衰竭共23例,占药物性病因的56.10%(41例).除药物性肝损伤外,其他病因均男性多于女性.三类肝衰竭总治愈,好转率为35.56%,HEV感染性肝衰竭的治愈,好转率高于药物性肝衰竭(x2=4.42,P<0.05),其他组间差异无统计学意义.结论 不同类型肝衰竭主要病因不同;HBV感染居肝衰竭病因之首,酒精性、药物性肝衰竭呈上升趋势;HEV感染性肝衰竭治愈、好转率相对较高.     

凋亡抑制蛋白survivin在白血病细胞中的表达及其意义

目的探讨白血病原代细胞中凋亡抑制蛋白survivin基因的表达情况,及其与疗效的关系.方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测45例白血病患者和10例健康人骨髓中survivin的表达水平,并给与合适的方式化疗,评判疗效.结果白血病细胞中survivin mRNA 阳性率为68.9%（31/45）.急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中survivin mRNA表达阳性率为73.3%,较急性髓系白血病（AML）的63.6%稍高;慢性粒细胞白血病（CML）患者中survivin mRNA 表达率很高,可达80.0%,慢性淋巴细胞白血病（CLL）中则为66.7%,但均高于正常对照组的20.0%（P＜0.05）.在22例AML患者中,survivin mRNA表达阴性者接受2个疗程化疗后缓解率（CR）87.5%,明显高于表达阳性患者的64.3%.在15例ALL患者中也有类似的结果,CR分别为100%和81.8%.CML患者中,survivin mRNA阳性的4例中有2例两年内发生急变;CLL患者病情均较稳定.结论survivin基因在白血病细胞中有较高的表达,并与疗效及预后有密切的关系.