凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

E2F-1基因对HepG2肝癌细胞增殖影响的研究

目的了解转录因子E2F-1对肝癌细胞HepG2增殖的影响。方法脂质体Lipofectami-neTM2000将pCMV-E2F-1-HA2载体转染HepG2肝癌细胞,然后用含G418的培养液筛选获得具有Genectin抗性的过表达E2F-1的肝癌细胞株。通过MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖的变化。结果 MTT和克隆形成实验结果显示,过表达E2F-1的HepG2/E2F-1细胞组与HepG2/EV细胞组和HepG2细胞组相比,其增殖速度明显减慢(P<0.01)。结论 E2F-1基因过表达可抑制HepG2肝癌细胞的增殖。     

12-脂肪氧化酶抑制剂诱导人肝癌细胞凋亡及其对survivin基因表达的影响

目的: 探讨12-脂肪氧化酶(12-LOX)抑制剂诱导人肝癌细胞凋亡的作用及其对survivin基因表达的影响。 方法: 对人肝癌细胞株HepG2进行细胞培养，取指数生长期细胞设对照组、12-LOX抑制剂组（baicalein 20、40和80 μmol•L^-1组），加试剂后继续培养72 h。透射电镜观察抑制剂组和对照组细胞形态。RT-PCR法分别检测实验组和对照组肝癌细胞12-LOX mRNA的表达情况。MTT 法检测细胞增殖情况。DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。RT-PCR法检测survivinmRNA的表达。结果: 人肝癌细胞株HepG2中存在12-LOX mRNA的明显表达，baicalein干预后，12-LOXmRNA表达量明显减弱。透射电镜下发现，对照组细胞胞核和细胞器亚微结构清晰，核膜完整；而经baicalein处理后，凋亡细胞增多，而且同一电镜切片中可以观察到不同时期的凋亡形态学改变，并可见坏死细胞及细胞碎片。MTT显示大致呈时间-剂量依赖性抑制细胞增殖，细胞存活率随着baicalein给药后时间的延长和给药浓度的增加而逐渐下降(P<0.05)；baicalein 干预后HepG2细胞提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可见梯形条带，而对照组未出现梯形条带。12-LOX抑制剂baicalein可降低HepG2细胞中survivin表达，并呈浓度-时间依赖性。结论： 12-LOX抑制剂能诱导人肝癌细胞HepG2的细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的机制可能与下调抗凋亡基因survivin的表达有关。     

重组核心蛋白聚糖转染对HepG2细胞p21WAF1/CIP1表达的影响

目的：将已构建完成的分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体转染到HepG2细胞中并检测核心蛋白聚糖及p21^WAF1/CIP1的表达,探讨核心蛋白聚糖抗肿瘤作用的机制。方法：HepG2细胞分为转染pcDNA3.1-DCN载体的转染组和转染pcDNA3.1空载体的对照组,脂质体介导核心蛋白聚糖真核表达载体及质粒pcDNA3.1载体分别转染到HepG2细胞中,经G418筛选建立稳定转染的细胞株,采用RT-PCR法检测核心蛋白聚糖和p21^WAF1/CIP1 mRNA表达;Western blotting法检测核心蛋白聚糖和p21^WAF1/CIP1蛋白质的表达;免疫组化法检测核心蛋白聚糖蛋白质的表达。结果：RT-PCR检测转染组细胞核心蛋白聚糖及p21^WAF1/CIP1 mRNA表达的灰度比值均高于对照组 (P<0.05),Western blotting检测核心蛋白聚糖及p21^WAF1/CIP1 蛋白质表达的灰度比值也高于对照组 (P<0.05),免疫组化检测转染组细胞核心蛋白聚糖蛋白质表达的阳性细胞计数高于对照组 (P<0.05)。结论：成功建立了稳定转染核心蛋白聚糖的HepG2细胞株,并证实核心蛋白聚糖能够提高p21^WAF1/CIP1mRNA和蛋白质的表达。     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建和表达及对HeLa细胞的影响

目的应用RNA干扰技术(RNAi)针对凋亡抑制因子survivin存活素的siRNA抑制Hela细胞株内源survivin基因的表达以及可促进Hela细胞凋亡。方法构建重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2并分别转染Hela细胞株,通过免疫荧光和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化,并通过流式细胞仪使用PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞株的凋亡。结果构建的2种重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE-1和pshRNA阴性非特异对照质粒;通过半定量RT-PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少;通过PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞的凋亡分别达(36.02±2.12)%(P<0.01)和(35.29±2.02)%(P<0.01)。结论重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均可明显抑制Hela细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进Hela细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。     

Double lethal effects of fusion gene of wild-type p53 and JunB on hepatocellular carcinoma cells

This study explored the double lethal effects of pEGFP-C1-wtp53/junB fusion gene on hepatocellular carcinoma (HCC) cells.wtp53/junB fusion gene was constructed and transformed into HepG2 cell line.Expression of KAI1 was detected by quantitative real-time PCR and Western blotting,cells apoptosis rate was detected by flow cytometry,proliferation of cells was detected by MTT chromometry,cell transmigration was detected by using transwell systems.The results showed that after transformation with pEGFP-C1-wtp53/JunB,the expression level of KAI1 protein was up-regulated,being 8.13 times the blank control group in HepG2 cells and significantly higher than 2.87 times which transformed with pEGFP-C1-JunB,3.11 times which transformed with pEGFP-C1-wtp53 (P<0.001).Apoptosis rate of HepG2 cells transformed with pEGFP-C1-wtp53/JunB was significantly higher than that of other groups (P<0.001),and invasive ability of HepG2 cells transformed with pEGFP-C1-wtp53/JunB was significantly lower than other groups (P<0.001).It was concluded that the fusion gene of wtp53 and JunB could not only inhibit the growth of hepatoma cells and promote tumor cell apoptosis,but also suppress the invasive ability of tumor cells by up-regulating the expression of KAI1.     

转录因子E2F-1过表达抑制胃癌细胞MGC-803的增殖

目的 了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响。方法 PCR扩增E2F-1基因片段;然后经限制性内切酶 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选。用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株。RT-PCR和Western blotting技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况。对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率;流式细胞仪检测各组细胞周期分布。结果 RT-PCR和Western blotting 实验证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1。MTT法检测发现,与MGC-803/EV细胞组和MGC-803细胞组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61±5.19)% vs （93.4±10.29）%、（100±0.00）%,均P <0.01);细胞周期分析显示MGC-803/E2F-1组的细胞在G0/G1期所占比例为70.63%,高于MGC-803/EV组（60.03%,P<0.01）和MGC-803细胞组（60.43%,P<0.01）;MGC-803/E2F-1组的细胞在S期所占比例为(11.27%),明显低于MGC-803/EV组（28.70%,P<0.01）和MGC-803细胞组（29.70,P<0.01）。结论 E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期。     

减毒沙门菌携带survivin特异性siRNA对肝细胞癌的生长抑制作用及其相关机制

目的：探讨survivin特异性siRNA对肝细胞癌HepG2细胞的生长抑制作用及减毒沙门菌携带survivin siRNA对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长抑制作用及其相关机制。方法：针对survivin的siRNA表达载体,脂质体和空质粒2个对照组分别转染肝细胞癌HepG2细胞后,应用RT-PCR和Western blott...     

survivin基因在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

目的: 探讨survivin基因在膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder,TCCB)发生、发展和复发中的作用。方法: 对53例膀胱移行细胞癌和10例正常膀胱黏膜应用原位杂交方法检测survivin mRNA的表达。结果: survivin mRNA在正常的膀胱黏膜中无表达,在TCCB中的阳性表达率为71.7%,两者差异有统计学意义(P<0.005);survivin mRNA在TCCB中的阳性表达率随TCCB的病理分级、临床分期升高而增高,在G₁、G₂和G₃级TCCB中的阳性表达率分别是50.0%、68.2%和94.1%,差异有统计学意义(P<0.005);在表浅性和浸润性TCCB中的阳性表达率分别为50.0%、92.6%,阳性表达率两者差异有统计学意义(P<0.01);在初发和复发TCCB中的阳性表达率分别为66.7%、85.7%,两者阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)。结论: survivin mRNA高水平表达在TCCB的发生、发展和复发中发挥了重要作用。     

siRNA对HepG2细胞survivin表达的抑制作用

目的　研究siRNA对肝癌细胞株HepG2中survivin基因表达的抑制作用。 方法　设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体PSilencer 2 .1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染HepG2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。 结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的PSilencer( ) survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达 ,从而为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

转录因子E2F-1在胃癌中的定量和定性表达及临床意义

目的 探讨转录因子E2F-1在胃癌组织中的表达及临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和免疫组化检测E2F-1在胃癌组、癌旁组和正常对照组中的表达情况,并联系临床病理特征进行分析。 结果 胃癌组中E2F-1 mRNA的阳性表达率为72.4%（42/58）,癌旁组为50.0%（29/58）,正常对照组为27.9%（12/43）,组间比较差异有显著性（P<0.05）;E2F-1 mRNA在不同的临床分期、病理类型和有无淋巴结转移之间阳性表达率大致接近,差异无显著性（P>0.05）。胃癌组中E2F-1 蛋白的阳性表达率为65.5%（38/58）,癌旁组为43.1%（25/58）,正常对照组为23.3%（10/43）,组间比较差异有显著性（P<0.05）;E2F-1 蛋白在不同的临床分期、病理类型和有无淋巴结转移之间阳性表达率大致接近,差异无显著性（P>0.05）。结论 E2F-1 mRNA和E2F1蛋白均在胃癌组织中具有较高的表达量,其转录表达量与各类临床病理特征之间没有必然联系,提示E2F-1的高表达可能与胃癌的发生有关。     

pEGFP-C2-人类P100蛋白SN和TD片段质粒构建

目的:分别构建含有人类p100蛋白SN片段和TD片段基因的真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2-p100-SN和pEGFP-C2-p100-TD。方法:利用EcoRI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒PSG5-p100-SN和PSG5-p100-TD进行双酶切以获得目的片段p100-SN和p100-TD基因片段,回收纯化后连接到质粒pEGFP-C2上。结果:通过对重组质粒进行菌落PCR鉴定以及酶切鉴定均能从PCR产物和酶切产物中观察到p100-SN和p100-TD片段。结论:成功构建了可以在真核细胞内表达绿色荧光蛋白和目的蛋白的融合蛋白的重组质粒pEGFP-C2-p100-SN和pEGFP-C2-p100-TD,可为有关人类p100蛋白功能及作用机制研究奠定基础。     

5F对非小细胞肺癌NCI-H460细胞survivin、p65和bcl-2mRNA的影响

目的：研究5F对非小细肺癌NCI—H460细胞survivin、p65和bcl-2mRNA水平的影响。方法：MTT法检测5F对NCI—H460细胞的生长抑制作用;用半定量RT—PCR方法检测survivin、p65及bcl一2mRNA水平的变化。结果：5F抑制NCI—H460细胞的生长,其效果与5F的浓度和作用时间相关,24、48、72h的IC50分别为：21．40、4．52、1．02μg·mL^-1：100μg·mL^-1。5F作用NCI—H460细胞6h后能引起survivinmRNA水平显著的降低（P〈0．05）,24h后出现增加（P〈0．05）;p65和bcl-2mRNA水平在作用3h就发生明显减少（P〈0．05）。结论：5F诱导NCI—H460细胞凋亡的机制可能是通过抑制survivin、p65和bcl-2mRNA水平来发挥作用的。     

子宫内膜癌中E2F-1和Survivin的表达及相关性

目的检测子宫内膜癌组织中E2F-1和Survivin表达情况并探讨其意义。方法采用免疫组织化学S-P法检测60例子宫内膜癌、32例正常子宫内膜组织中两者的表达。结果子宫内膜癌组织中E2F-1和Survivin表达定位于细胞核,其阳性表达率分别为58.33%（35/60）和55.00%（33/60）,均明显高于正常子宫内膜组织0和0（P〈0.05）。两者的表达与有无淋巴结转移、浸润深度、临床分期及病理分期有关（P〈0.05）;通过相关性分析E2F-1和Survivin在子宫内膜癌组织中呈正相关（P〈0.05）。结论 E2F-1和Survivin在子宫内膜癌呈成过度表达,两者共同作用参与子宫内膜癌的发生、发展及转移。     

FOXO3a在三氧化二砷诱导肝癌HepG2细胞周期阻滞中的作用

目的探讨三氧化二砷（As2O3）对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其与细胞周期素依赖性激酶抑制剂（CDKI）p27kip1和p27kip1相关蛋白FOXO3a的关系。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2经2μmol/L As2O3处理72 h,用流式细胞仪检测细胞周期变化,并采用核浆分离、Western blot技术及细胞免疫荧光技术检测该过程中p27kip1和FOXO3a在HepG2细胞中的表达变化和亚细胞定位情况。结果与对照组比较,As2O3使HepG2细胞周期阻滞在G2/M期,并诱导凋亡。As2O3作用后,HepG2细胞的p27kip1蛋白和FOXO3a蛋白总量也增加,并且p27kip1的表达变化与FOXO3a的表达水平高低及核-胞浆易位相关。结论 As2O3可能通过上调FOXO3a的表达影响p27kip1基因的转录,从而调控肝癌细胞的增殖。     

新型斑蝥素类似物LB1协同阿霉素杀伤肝癌细胞的实验研究

目的通过水溶性化学小分子蛋白磷酸酶2A抑制剂LB1与阿霉素(doxorubicin,DOX)联合应用,研究其在肝癌化疗过程中的协同作用。方法体外细胞活性分析检测不同剂量LB1对HepG2细胞活性影响及其与阿霉素(DOX)的协同杀伤效应;通过裸鼠体内荷瘤模型以及组织化学分析,进一步观察LB1对肿瘤生长影响以及在体与阿霉素的协同化疗作用。结果 LB1对HepG2细胞生长与作用剂量相关,低剂量时可促进其生长,高剂量时则促进其凋亡,而且在联合阿霉素后,可显著提高对HepG2肿瘤细胞的杀伤作用;体内实验也发现,单纯给予阿霉素抑瘤率为57%,而LB1联合应用后,抑瘤率可达77%,显著提高了阿霉素对肿瘤的杀伤作用(P<0.05),且无明显毒副作用。结论 LB1联合应用可显著提高阿霉素(DOX)对肝癌细胞的化学杀伤作用。     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.