恙虫病东方体的分离及外膜蛋白基因序列分析

目的 对福建省平潭岛的恙虫病病人、宿主动物和媒介恙螨进行现场调查和恙虫病东方体分离，并对其56kD外膜蛋白基因序列进行测定和分析．为有针对性的防制提供依据。方法 将病人血、鼠脏器、地里纤恙螨标本分别腹腔接种小白鼠分离东方体，小鼠腹壁刮液经Gimesa染色镜检；PCR扩增分离株的东方体56kD外膜蛋白基因片段．并进行测序及多序列比较和进化树分析。结果 其中1份病人血标本、1份鼠脏器标本及1份恙螨标本腹腔接种的小白鼠，12d后出现耸毛、弓背、厌食、腹部增大等典型东方体感染症状，解剖后见肝脾肿大或腹水，显微镜下清淅可见细胞浆内短杆状或球杆状东方体，共分离出Pt1、Pt2、及Pt33株东方体。3株东方体用设计的引物分别扩增出约1350bp特异性56kD基因片段。序列测定结果表明，此3株东方体之间56kD基因片段同源性大于99％。它们与Ot标准株Karp、Kato、GiUiam及地方株Kawassaki、Kuroki的同源性分别为93．8％，66．2％，85．1％，69．6％，84．2％。结论 从恙虫病病人、宿主及媒介均分离到恙虫病东方体，证实了平潭岛恙虫病春季恙虫病的存在，并从分子水平上证实该分离株与Karp株同源性较高。     

恙虫病东方体56kDa抗原基因片段在不同载体的表达

目的 构建恙虫病东方体56kDa表面抗原基因(sta56)片段在不同载体的重组表达质粒，在E．coli中表达sta56重组抗原并比较不同表达系统对sta56的表达效果。方法 从含有恙虫病东方体Karp株sta56基因的重组克隆，扩增出不同长度的截短的sta56片段．定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，转化大肠埃希菌DH5a或BL21(DE3)，IPTG诱导表达，应用十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白表达情况。应用蛋白印迹(WB)方法分析重组抗原的活性。结果 成功构建含sta56不同长度片段的重组表达质粒pHTbOt957、pHTbOt498、pHTbOt342和pETOt957、pETOt498、pETOt342，各重组子均可在E．coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS-PAGE显示各表达重组子表达不同分子量的重组蛋白，WB证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。结论 恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠埃希菌获得高效表达，pET30a对sta56的表达效果优于pPROEX HTb；重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原。     

恙虫病东方体山东分离株Sta56基因全序列扩增及酶切分析

目的明确山东恙虫病东方体（Ot）分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系。方法对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应（PCR）扩增；选取4种内切酶HinfⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、PstⅠ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）；对代表株XDM2株Sta56基因全序列测序，运用Clustal X（5、0）和PHYLIP软件对测得的序列与GenBank中已知的Ot序列构建系统发育树，进行比较分析。结果患者分离株B-16、黑线姬鼠分离株FXS2和小盾纤恙螨分离株XDM2均扩增出接近1．6kbp的目的条带。Ot山东分离株PCR扩增产物经HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、RstⅠ酶切后图谱一致，但与国际参考株Gilliam、Karp、Kato株的RFLP图谱均不相同；虽与日本地方株Kawasaki株的酶切图谱有相似之处，但存在酶切位点的突变。序列同源性分析结果显示，山东地区代表株XDM2株Sta56基因全序列与Kawasaki型相应的序列同源性最高，为97％，氨基酸序列同源性为92％。结论经Sta56基因全序列分析，仇山东分离株基因型虽与日本Kawasaki型相似，但也存在差异。     

山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查

目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体（Ot）情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性.方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定.结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带.对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份（LHGM2株）为Karp型.序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果：XDM2株首轮PCR产物碱基序列与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97.00%,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型;LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96.45%,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型.结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型.     

我国恙虫病东方体分子流行病学研究进展

恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)引起的以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床表现的一种自然疫源性疾病。在我国恙虫病流行原仅限于长江以南广大地区,但自1986年以来,秋冬型恙虫病作为一种新发传染病,于我国北方地区出现暴发和流行。     

山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析

目的鉴定山东地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列。方法以日本、韩国常用的恙虫病东方体分型引物,用巢式PCR技术检测恙虫病东方体分离株的相对分子质量(Mr)56×103蛋白基因片段,对群引物扩增的PCR产物纯化回收后测序,并行序列分析。结果Gilliam、Karp、Kato、山东分离株用群引物均扩增出481-507 bp的目的片段,Gilliam、Karp、Kato经相应的型引物扩增出了目的片段。山东分离株仅Kawasaki型的分型引物扩增出目的条带,序列分析证实山东分离株与Kawasaki型相似。结论在国内首次扩增出Gilliam、Karp、Kato三型标准株,山东地区恙虫病东方体分离株为Kawasaki型;山东地区恙虫病东方体与日本的Kawasaki型相似,两者有较近的亲缘关系。     

东北地区恙虫病东方体分离株sta 56基因片段的扩增及序列分析

为了解东北地区恙虫病东方体分离株与其参考株的同源关系,采用了PCR技术扩增东北地区恙虫病东方体分离株sta56基因片段,测定HCAa9202和HCM9501株sta56基因片段的核苷酸序列,并与已知列的参考株进行同源性比较。结果显示,东北地区恙虫病东方体分离株均可在320～332bp范围内见到特异性扩增带,但MSAa9302株和MSAa9304株在此范围内分别可见2条和3条扩增带。HCAa9202株和HCM9501株与6个已知序列的恙虫病东方体菌株相比较同源性在67.72％～83.18％间,相对与Gilliam的同源性较高。     

山东地区恙虫病东方体Sta56基因片段扩增与分型研究

目的 鉴定山东地区恙虫病东方体(Ot)基因型别。方法 采用巢式聚合酶链反应技术对23株恙虫病东方体山东株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及10份恙虫病患者全血中提取的Ot目的基因进行分析研究,并与Gilliam、Karp、Kato国际参考株进行比较。将群引物扩增产物用双向测序法进行序列测定。结果 35份标本中33份属于Kawasaki型,2份(FXS4 and LHGM2株)属于Karp型。从这33份中选出B-16、FXS2株进行碱基序列测定,结果B-16、FXS2株Sta56基因片段序列与Kawasaki型同源性最高,分别为94.22％、95.21％,而与其他6株Ot同源性均<75.87％.应属于Kawasaki型;FXS4和HGM2株Sta56基因片段序列与Karp型同源性最高,分别为83.03％、96.45％,应属于Karp型。结论 山东地区恙虫病东方体流行株以Kawasaki型为主,但同时存在Karp型。     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

东北地区恙虫病东方体分离株sta56基因片段的扩增及？…

为了解东北地区恙虫病东方体分离株与其参考析的同源关系。采用了ＰＣＲ技术扩增东北地区恙虫病东方体分离株ｓｔａ５６基因片段,测定ＨＣＡａ９２０２和ＨＣＭ９５０１株ｓｔａ５６基因片段的核苷酸序列,并与右列的参考株进行同源性比较。结果显示,东北地区恙虫病东方体分离株均可在３２０～３３２ｂｐ范围内见到特异性扩增带,但ＭＳＡａ９３０２株和ＭＳＡａ９３０４株在此范围内分别可见２条和３条扩增带。ＨＣＡａ９２０２株     

PCR/SSCP在恙虫病东方体基因分型中的应用

目的采用优化聚合酶链反应/单链构象多态性分析(PCR/SSCP)方法分析恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)基因型的各项条件.方法对恙虫病东方体山东分离株、小盾纤恙螨匀浆及恙虫病人全血中提取的Ot Sta56基因进行分析.采用PCR/SSCP检测,并与Nested PCR基因分型的结果进行比较.结果山东地区35份标本提取的Ot-DNA群引物扩增产物呈现出2种不同的单链构象图谱,其中33份与国际参考株Gilliam,Karp,Kato均不相同,应属这3型以外的一种基因型,经Nested PCR分型证实为Kawasaki型;2份与Karp株相同.表明山东地区恙虫病东方体至少存在2种型别.检测结果与Nested-PCR基因分型结果相符.条件优化以8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,常温下,200V电泳3 h获得的电泳结果较为理想,并易于操作.结论PCR/SSCP条件优化后可用于快速分析恙虫病东方体基因型,且操作简便,结果准确.     

恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR/RFLP分析

目的：鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型。方法：采用PCR／RFLP技术对恙虫病东方体黑龙江分离株的sta56基因及其酶切图谱进行分析研究，并与国际参考株进行比较。结果：6株分离株的PCR特异性产物经Hinf I、Hha I、Rsa I酶切后呈现3种不同的RFLP图谱；MSAa9301株、NSAa9303株、MSAa9304株及MSAp9305株与Gilliam参考株具有相似的酶切图谱，但缺乏Hinf I的酶切位点，属于Gilliam型；MSAa9306株与Karp参考株具有相同的酶切图谱，属于Karp型；MSAp9302株与Kato参考株具有相同的酶切图谱，属于Kato型。结论：黑龙江密山地区恙虫病东方体分离株存在Gilliam,Karp和Kato 3种型别。     

秋冬型恙虫病病人、恙螨、鼠东方体基因型研究

目的 了解秋冬型恙虫病流行季节黑线姬鼠、小盾纤恙螨、病人体内恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)基因型的一致性。方法采用Nested PCR结合限制性内切酶片段长度多态分析(RFLP)技术对山东地区恙虫病流行季节病人、野外优势鼠种黑线姬鼠、鼠体外优势螨种小盾纤恙螨标本中Ot-Sta56基因型进行分析。结果 应用PCR／RFLP分析了12株分离自山东秋冬型恙虫病流行季节病人、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内的ot，2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及10份恙虫病人全血中的Ot-sta56目的基因，24份标本酶切图谱经与已知序列的ot内切酶图谱相比，与日本地方株-Kawasaki株具有相似的酶切图谱，但缺乏HhaⅠ的酶切位点；24份标本提取的Ot-DNA扩增产物分别经型引物扩增，均出现相应分子量的扩增片段，皆属日本地方株Kawasaki型。结论 秋冬型恙虫病流行季节病人、野外优势鼠种黑线姬鼠、鼠体外优势螨种小盾纤恙螨体内所分离的恙虫病东方体Sta56基因型是一致的，并在病人、黑线姬鼠、小盾纤恙螨间构成相互传播关系，这对当地恙虫病疫源地的维持有重要作用。     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

重组人类抗砷相关基因在大肠埃希菌的表达

目的 构建含重组人类抗砷相关基因(human arsenic resistence related gene，hARRG)的表达载体，诱导其在转化菌表达，分离纯化表达蛋白，研究该蛋白质的理化性质、抗砷功能和免疫活性，深入研究人类对砷化物的抵抗作用。方法 将hARRG cDNA开放阅读框亚克隆到原核表达载体Pet11C中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达蛋白质。利用阴离子交换柱Sepharose纯化蛋白质，SDS-PAGE胶电泳观察结果。结果 将hARRG cDNA成功亚克隆到原核表达载体Pet11C中，并成功在大肠杆菌中表达，表达的hARRG蛋白占菌体蛋白的5％左右，该蛋白质被分离纯化。结论 原核表达载体Pet11C可以在大肠杆菌中表达hARRG cDNA，可用阴离子交换柱Sepharose纯化抗砷相关蛋白质。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶原核表达、纯化及鉴定

目的原核表达日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）,对表达产物进行纯化及生物活性鉴定。方法将SjLDH编码序列克隆入pET-28a原核表达载体并转染大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后亲和层析法对表达产物进行纯化,并用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白印迹（Western blot）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、酶活性染色及活性测定进行鉴定。结果成功构建pET28a-SjLDH重组质粒并在大肠埃希菌中获得可溶性表达,亲和层析纯化表达产物。SDS-PAGE及Western Blot结果显示,表达及纯化产物分子量约36kDa,与SjLDH理论分子量相符。ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,酶活性染色表明重组蛋白具有乳酸脱氢酶活性,活性单位为379U/mg。结论成功进行SjLDH的原核表达并获得纯化的重组蛋白,重组蛋白具有良好的免疫原性及酶活性,为研究SjLDH的功能奠定了基础。